“反相”和“正相”是液相色谱法早期提出的概念，当时键合相色谱柱尚未出现，固定相被涂覆在载体表面，极易流失。为此，科学家对流动相的使用，给出了合理的建议：流动相极性与固定液极性应具有较大差别，以减少固灌航失。固定相极性弱于流动相时的液相色谱法，被称为反相色谱法，固定相极性强于流动相时的液相色谱法，被称为正相色谱法。尽管目前键合相色谱柱已成为主流，但这一概念在色谱方法开发、预测出峰顺序等方面仍具有重要的意义。

由上面的介绍可知，具体的色谱方法、色谱柱属于正相还是反相，不仅取决于固定相极性，同时，还取决于流动相极性。C₁₈(硅胶键合十八烷基硅烷)、C₈(硅胶键合辛基硅烷)、phenyl(硅胶键合苯基硅烷)等色谱柱，由于固定相极性极低，因而是标准的反相柱；Silica(硅胶)、NH₂(硅胶键合氨丙基硅烷)具有较高的极性，主要用于分离带有极性基团的化合物，所用流动相的极性通常低于这些固定相，因而是标准的正相柱。CN(硅胶键合腈丙基)色谱柱的极性介于正相和反相之间。当流动相极性超过CN时，它属于反相柱；反之，则是正相柱。

色谱柱内径决定载样量，载样量与内径的平方成正比。色谱柱长度与塔板数成正比，与柱压成正比，柱长越长，分离度越好，但时间会越长。粒径影响涡流扩散相，粒径越小，涡流扩散相越小，柱效越高，粒径与柱效近似成反比。粒径越小，压力也越大，压力与粒径的平方成反比，但粒径越小，分离度会越高。填料孔径对分析对象的相对分子质量有限制，当孔径为分析物尺寸的5倍以上时，分析物才能顺利通过孔隙，孔径处于6～12nm的色谱柱，适用于相对分子质量小于10000的分析物；孔径为30nm的色谱柱，可以满足相对分子质量处于10000以上的大分子化合物分析。

液相色谱分析中如何才能提高分离度？

通过分离度计算公式可以了解影响分离度的要素，下式为分离度(Rs)计算公式：

Rs=1/4(N0.5)(a-1)[k/(k+1)]

N表示柱效(Efficiency)，反映色谱柱性能。柱效越高，分离度越好。在其他条件恒定的情况下，塔板数增加一倍，分离度仅提高40%。操作中，可通过下面两种方式增加塔板数，进而提高分离度：其一，使用长柱或双柱串联，但这也会使分离时间大大延长；其二，使用细粒径填料的色谱柱，但这需要耐更高压力的液相色谱系统。相比之下，后者更为可取。

a表示选择性(selectivity)，反映色谱柱一流动相体系分离两个化合物的能力。选择性主要与固定相、流动相组成以及柱温等因素有关，与保留值也密切相关，其中，固定相和流动相组成影响较大。以最常见的反相模式为例，反相柱(包括C₁₈、C₈、PH等)是以分配作用对化合物进行保留的，不同化合物的分离是基于它们在键合相与流动相中分配系数的差异，如果两种化合物的水溶性、在烷烃一水体系的分配系数等方面存在明显差异，那么这些化合物通常能够利用反相柱达到分离；PH柱对有苯环的化合物具有特殊保留。正相模式下，硅胶柱、氨基柱、氰基柱与带有极性基团的化合物之间，存在极性相互作用，对化合物的基团具有选择性，常常用于结构类似物、异构体化合物的分离。流动相方面，降低流动相的洗脱强度，通常可以增大分离度。而有机溶剂类型也会影响分离，比如反相条件下，乙腈和甲醇的选择性就存在很大差异，这种差异需要在实践中摸索，但无论如何，多种溶剂类型带给我们更多实现分离的可能。

k表示随着容量因子k的增大，分离度也随之增加，这种影响在k值较低时非常明显。当k值大于10时，k值增加对分离度的影响就不再显著，这就说明，无原则地提高k值以增大分离度是没有意义的。增加键合相密度，能够提高k值。另外，改变键合基团类型也能改变k值，比如在反相色谱中，随着键合相碳链长度的增加，k值逐渐增大。

什么是梯度洗脱？什么情况下使用梯度洗脱？

为了改善分析结果，某些操作需要连续改变流动相中各溶剂组分的比例，以连续改变流动相的极性，使每个分析组分都有合适的容量因子k，并使样品中的所有组分可在最短时间内实现最佳分离，这种洗脱方式称为梯度洗脱。

梯度洗脱可在下列情形中发挥重要作用：

(1)在等度下具有较宽k值的多种样品分析。

(2)大分子样品分析。

(3)样品含有强保留的干扰物，在目标化合物出峰后设置梯度洗脱，将干扰物洗脱出来，以免其影响下一次数据采集。

(4)分析方法建立时，不知道其洗脱情况，使用梯度洗脱，找出其较优的洗脱条件。

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文章来源：《农产品质量安全检测》

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