5 试验方法

5.1 受试物

受试物应使用原始样品,若不能使用原始样品,应按照受试物处理原则对受试物进行适当处理。

5.2 实验动物

5.2.1 动物选择

常用健康年轻的成年大鼠或小鼠,如使用小鼠,可选择7周龄～12周龄,试验开始时动物体重的差异不应超过平均体重的20%。动物应随机分组,每组雌性和雄性动物至少各5只。如果试验设有几个采样时间点,则要求每组每个性别每个采样时间点都有5只能用于分析的动物。

5.2.2 动物准备

试验前动物在实验动物房至少应进行3d～5d环境适应和检疫观察。

5.2.3 动物饲养

实验动物饲养条件应符合GB14925、饮用水应符合GB5749、饲料应符合GB14924的有关规定。试验期间动物自由饮水和摄食,每笼动物数应满足实验动物最低需要的空间，以不影响动物自由活动和观察动物的体征为宜。

5.3 剂量

应进行预试验以选择最高剂量。如果受试物具有毒性,应设3个剂量,最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和(或)个别动物出现死亡的剂量,一般可取1/2LD₅₀,低剂量组应不表现出毒性,分别取1/4LD₅₀和1/8LD₅₀作为中、低剂量。对于在低或无毒剂量下具有特异生物学活性的物质(如激素和丝裂源)可以抑制骨髓细胞有丝分裂指数(50%以上)为指标确定最高剂量，按等比级数2向下设置中、低剂量组。急性毒性试验给予受试物最大剂量(最大使用浓度和最大灌胃容量)动物无死亡而求不出LD₅₀,并且根据结构相关物质资料不能推断受试物具有遗传毒性时,则不必设3个剂量。按以下顺序只设一个剂量：

a)10g/kg体重；

b)人的可能摄入量的100倍；

c)一次最大灌胃剂量,连续染毒14d。另设溶媒对照组和阳性对照组,如果没有文献资料或历史性资料证实所用溶媒不具有有害作用或致突变作用，还应设空白对照组。阳性对照物可用丝裂霉素C(1.5mg/kg体重～2.0mg/kg体重)或环磷酰胺(40mg/kg体重)经口或腹腔注射给予。

5.4 试验步骤

5.4.1 给予受试物方式

经口给予受试物,受试物溶液一次灌胃量不应超过20mL/kg体重.采用一次染毒或多次染毒方式。一次染毒应分两次采集标本，即每组动物分两个亚组，亚组1于染毒后12h～18h处死动物采集第一次标本,亚组2于亚组1动物处死后24h采集第二次标本。如果采用多次染毒方式,可给予受试物2次～4次,每次间隔24h,在末次染毒后12h～18h采集一次标本。处死动物前3h～5h,按4mg/kg体重腹腔注射秋水仙素。

5.4.2 取材

颈椎脱臼法处死动物,迅速取出股骨,剔去肌肉，擦净血污,剪去两端骨髓,用带针头的注射器吸取5mL生理盐水,插入骨髓腔,将骨髓洗入10mL离心管,然后用吸管吹打骨髓团块使其均匀,将细胞悬液以1000r/min离心10min,弃去上清液。

5.4.3 低渗

离心后的沉淀物加入7mL 0.075mol/L氯化钾溶液,用滴管将细胞轻轻吹打均匀,放入379水浴中低渗10min～20min。

5.4.4 预固定

立即加入1mL～2mL固定液(甲醇：冰醋酸=3:1),以1000r/min离心10min,弃去上清液。

5.4.5 固定

加入7mL固定液,混匀，固定15min后，以1000r/min离心10min,弃去上清液，用同法再加固定液1次～2次,弃去上清液。

5.4.6 滴片

加入数滴新鲜固定液,用滴管充分混匀。将细胞悬液均匀的滴于冰水玻片上,轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个标本制2张～3张玻片，空气中自然干燥。

5.4.7 染色

用GiemSa染液染色15min,去离子水冲洗,空气中自然干燥。

相关链接：哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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