6 测定步骤

6.1 提取

称取蜂王浆2g(精确至0.01g)，置于50 mL离心管中，加入5 mL EDTA-McIlvaine缓冲溶液，在混匀器上混匀1 min，再加入5 mL甲醇混匀，离心(2500g)10 min，上层清液转移到50 mL容量瓶中。下层沉淀加10 mL EDTA-McIlvaine缓冲溶液，混匀1 min，离心(2500g)5 min后，把上层清液转移到50 mL容量瓶中。重复操作一次。用EDTA-Mcllvaine缓冲溶液把提取液定容至50 mL。取25 mL～50 mL移入离心管中，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH为6.0，待净化用。

6.2HLB固相萃取柱净化

将上述提取液过预先淋洗好的HLB固相萃取柱，再用5 mL甲醇水溶液(3.14)淋洗，减压抽干20 min，弃去全部淋出液。加10 mL甲醇-乙酸乙酯混合液(3.15）以1 mL/min的流速洗脱，收集洗脱液，摇匀。

6.3 离子交换柱净化

将上述溶液转入预洗好的离子交换柱(3.23)，再用5 mL甲醇淋洗，减压抽干5 min，弃去全部淋出液。用4 mL草酸-乙腈混合液((3.17)以1 mL/min的流速洗脱，收集洗脱液，摇匀，供液相色谱-质谱/质谱联用仪测定。

6.4 测定

6.4.1 液相色谱-质谱/质谱仪条件

6.4.1.1 色谱柱：C₈柱，5 um, 250×4.6 mm(内径)或相当者。

6.4.1.2 流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

6.4.1.3 流速：400 uL/min。

6.4.1.4 进样量：20 uL。

6.4.1.5 离子源：电喷雾离子源。

6.4.1.6 扫描方式：正离子扫描。

6.4.1.7 检测方式：多反应监测。

6.4.1.8 雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求。

6.4.2 色谱测定

根据样液中待测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和样液中待测物的响应值均应在校正曲线线性响应范围内。在上述色谱条件下OTC、TC、DMCTC、CTC和DC的参考保留时间约为9.8 min、10.5 min、11.4min、12.3min和12.7min。

6.4.3 空白试验

除不加试样外，均按上述步骤进行。

7 结果计算和表述

用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中待测物含量。

式中：

X—试样中待测物的残留量，单位为微克每千克(ug/kg);

A—样液中待测物的峰面积；

c—标准工作液中待测物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

V—样液最终体积，单位为毫升(mL)；

A_s—标准工作液中待测物的峰面积；

m—最终样液所代表的试样量，单位为克(g)。

8 测定低限和回收率

8.1 测定低限

本方法对蜂王浆中土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素、强力霉素的测定低限均为2.0 ug/kg。

8.2 回收率

添加浓度在2.0 ug/kg、5.0ug/kg、10.0 ug/kg时，五种抗生素残留量测定的回收率如表2。

表2 五种抗生素残留最测定的回收率

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文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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