5 测定方法

5.1 方法提要

本方法的测定基础是间接竞争性酶联免疫反应，样本中的盐霉素与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗盐霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含盐霉素的含量成负相关，按绘制的校正曲线定量计算即可得出盐霉素的含量。

5.2 样品处理

称取2.0g试样均质物至离心管中，加入8 mL甲醇-8％氯化钠溶液，剧烈振荡5 min, 4 500g以上离心10 min；移取2 mL上清液加入4 mL 0.5 mol/L氢氧化钠-8％氯化钠溶液，混合均匀，再加入10 mL二氯甲烷，振荡5 min,4500g离心10 min；除去上层，取下层5mL、至试管中，于50℃～60℃水浴氮气吹干；

用1 mL复溶工作液溶解干燥的残留物；取50 uL用于分析。

5.3 酶联免疫法测定

5.3.1 操作条件

所有操作应在室温下(20℃～25℃)进行，盐霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(20℃～25℃)后方可使用。

5.3.2 测定步骤

测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。

在酶标板中分别加入50 uL不同浓度的盐霉素标准溶液和样品待测液；每个标准溶液和样品待测液均做2孔平行。再在每个孔中加入50 uL的抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，擎避光反应30 min。弃掉酶标板中的液体，用洗涤工作液250uL/孔充分洗板4次～5次。每孔再加入100uL酶标二抗，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，室温避光反应30 min。弃掉酶标板中的液体，用洗涤工作液重复洗板4次～5次。每孔加入底物液A液50 uL，再加底物液B液50uL，轻轻振荡混匀，室温避光反应15 min后，每孔加入终止液50 uL，轻轻振荡混匀，5 min内在酶标仪上读出每孔450 nm吸光值。

5.3.3 空白试验

除不称取试样外，均按上述步骤进行。

5.4 结果表述

百分吸光率的计算：标准品或样本的吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，见式(1)。

吸光度值＝B/B₀×100％······(1)

式中：

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；

B₀—0 ug/kg标准溶液的平均吸光度值。

以标准品吸光率为纵坐标，以盐霉素标准品浓度(ug/kg)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中盐霉素实际残留量。

也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算，所得结果表示至一位小数。

5.5 检测限、回收率

5.5.1 检测限

本方法的检测限为20 ug/kg。

5.5.2 回收率

本方法中盐霉素添加浓度及回收率的试验数据：

—添加浓度为10 ug/kg时，平均回收率为76％;

—添加浓度为20 ug/kg时，平均回收率为85.5％;

—添加浓度为50 ug/kg时，平均回收率为83％;

—添加浓度为100 ug/kg时，平均回收率为85.2％。

5.6 确证试验

如被测样品中盐霉素残留量的值大于检测限时，应用其他方法进行确证。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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