7 测定步骤

7.1 样液的制备

称取20 g试样(精确至0.1g)于均质杯内，加入80 mL缓冲液Ⅱ，以10000 r/min均质3 min。移入离心管中，以4000r min离心30 min二取上清液50 mL，于40℃旋转蒸发至约15 mL。转入分液漏斗中。分别用二氯乙烷20 mL、15mL、15mL三次提取。合并二氯乙烷提取液，于30℃旋转蒸发至干。加入5mL缓冲液Ⅲ，摇匀，作为样液。

7.2 菌悬液的制备

先将试验菌种(4.14)接种于营养肉汤培养基的试管内，经32℃～35℃培养18 h±1h。取1 mL菌液，加于盛有适量增菌用培养基的克氏瓶(内装培养基100 mL)。来回倾斜克氏瓶，使菌液均匀覆盖在琼脂表面。于32℃～35℃培养18h±1h。用约10 mL保存用培养基洗下菌苔，制成菌悬液。将菌悬液置于4℃冰箱中保存，可使用2周。

7.3 菌悬液用量的测定

在实际测定前，把不同量的菌悬液加入到定量检定培养基中，制成平板，能使0.05 ug/mL的标准工作液产生大于等于10mm清晰、完整的抑菌圈为最佳菌悬液用量。

7.4 平板的制备

将检定培养基熔化后，冷却至45℃～50℃。加入适量(从7.3测得)菌悬液，混匀。立即取6 mL,注入培养皿中，使培养基均匀覆盖在其底面，待其凝固。所用平板应于测试当天制备。

7.5 标准曲线的制备

以0.2ug/mL、浓度的标准工作液作为参考浓度。标准曲线上的每个标准工作液的浓度，均取3个检定平板作为一组。在每个检定平板上放置6个牛津杯，使牛津杯在半径为2.8cm的圆面成60^o角间距。在其中3个牛津杯内加满参考浓度溶液；另3个牛津杯加满一种标准工作液。参考浓度溶液与标准工作液间隔加入。将陶瓦盖盖好，置32℃～35℃培养20h±1h。翻转平板，除去牛津杯，精确地测量抑菌圈的直径(精确到0.1mm)。在5个标准浓度共15个平板中，最低浓度(0.025 kg/mL)的3个平板为判断阴性结果的对照，其他12个平板用来绘制标准曲线。参考浓度的工作液将得出45个抑菌圈直径的数值，其他浓度的工作液将得出。个抑菌圈的数值。求出每组3个平板上参考浓度的抑菌圈直径读数和其他浓度的抑菌圈直径读数的平均值，再求出参考浓度的所有45个抑菌圈直径数值的平均值。用参考浓度的抑菌圈直径的总平均值减去每组平板参考浓度的抑菌圈直径平均．值的差，即为每组平板的校正值。将校正后的值，用式(1)、式(2)算出L和H。在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径(mm)为纵坐标(算术级)。以标准工作液浓度(ug/mL)为横坐标(对数级)，标出L点和H点，通过I、点和H点连一直线即为标准曲线。

式中：

L—标准曲线上最低浓度抑菌圈直径，单位为毫米(mm);

H—标准曲线上最高浓度抑菌圈直径，单位为毫米(mm);

c—参考浓度0.2ug/mL的45个抑菌圈直径的平均值，单位为毫米(mm);

a,b,d,e—分别表示标准曲线上其他标准浓度(0.05、0.1、0.4、0.8)ug/mL,的抑菌圈直径经校正后的平均值，单位为毫米(mm)。

7.6 测定

每份试样取三个平板，在每个平板上放置6个已灭菌的牛津杯，使牛津杯在半径为2.8 cm的圆面成60^o角间距。在每个平板上相间隔的3个牛津杯内，加满螺旋霉素标准参考浓度工作液，另外3个牛津杯内加满被检样液。将陶瓦盖盖好，置32℃～35℃培养18h±1 h,翻转平板，除去牛津杯。如有抑菌圈产生，精确测量其直径；

8 结果计算和表述

8.1 如样液抑菌圈的直径小于10 mm，即报告为“未检出”。

8.2 如抑菌圈的直径大于等于10 mm，求出每组3个检定平板上样液和标准参考浓度工作液抑菌圈直径的平均值，经校正后，从标准曲线上查出相应的螺旋霉素的含量，由式(3)计算试样中螺旋霉素的含量。

式中：

X—试样中螺旋霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg) ;

c—从标准曲线上查出的样液中的螺旋霉素浓度，单位为微克每毫升(ug/mL) ;

m—每毫升最终样液所代表的试样量，单位为克(g)。

注：若测定结果为阳性，即所显抑菌圈的平均直径大于10 mm时，必要时，尚需进行确证实验(可用薄层色谱法或液相色谱串联质谱法)，以证明抑菌物确系螺旋霉素。

9 测定低限和回收率

9.1 测定低限

本方法的测定低限为0.05 mg/kg。

9.2 回收率

本方法的回收率试验数据

—添加浓度0.025 mg/kg时，回收率82.3％～104.6％;

—添加浓度0.2 mg/kg时，回收率85.3％～97.3％;

—添加浓度0.8 mg/kg时．回收率80.0％～96.2％。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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