3.4.1.16 从步骤3.4.1.13中得到的每一试样水相转入预先洗涤好的各注射器柱系统内。用步骤3.4.1.14 的方法，应用氮气使溶液流经柱体洗提，然后各取每一试样管水洗液1mL(经涡式混匀器混匀)，使用巴氏吸移管采用类似方法将水洗液分别转入各注射器柱系统内，弃去洗脱液。

3.4.1.17 再取每个试样管水洗液1 mL(经涡式混匀器混匀)，分别转入各注射器柱系统内，按步骤

3.4.1.15 的方法应用氮气使此水洗液流经柱体洗提，弃去洗脱液。

3.4.1.18 向每一注射器柱系统内分别加入2 mL甲苯，按步骤3.4.1.15的方法用氮气使甲苯流经柱体洗提，弃去洗脱液。

3.4.1.19 在每一注射器柱系统下面分别放置一15mL离心管，向每个柱系统内加入2 mL乙酸乙酯，按步骤3.4.1.15的方法用氮气使乙酸乙酯流经柱体进行洗脱。在这部分洗脱液中含有待测化合物。

3.4.1.20 向步骤3.4.1.19中得到的每份洗脱液中分别加入约0.5 mL甲醇，以涡式混匀器混匀，以得到均匀的溶液。

3.4.1.21 于35±5℃的水浴上在干燥氮气下将步骤3. 4. 1. 2。得到的洗脱液浓缩至干。

3.4.1.22 至干后，加入0.5 mL水-甲醇溶液(70+30)。以涡式混匀器混匀，重新溶解残渣。

3.4.1.23 30 min后，将每个重新溶解的试样加入微量过滤装置内，采用0.2 um再生纤维素滤膜过滤。然后将每个过滤器及试样提取液于4000r/min左右离心5～10min。

3.4.1.24 将滤液转入15 mL具塞玻璃离心管内，用水-甲醇(70+30)调节每一滤液体积为0.5mL,使用硅烷化管有助于将提取液浓缩于管的底部。以涡式混匀器混匀后移取0.1mL供HPLC分析。

3.4.2 测定

3.4.2.1 液相色谱条件

a．色谱柱：u Bondapak C₁₈柱，30 cm×3.9 mm内径；

b．流动相：68% 0.02 M KH₂PO₄：0.01 M二乙醇胺(200 mL 0.1 M KH₂PO₄+1.05g二乙醇胺，加水至1L)；

20％甲醇；

12％乙腈。

该溶液当日新配，使用前用0.45um滤膜过滤，并用真空系统抽气。

c．流速：1.8 mL/min;

d. 温度：室温。

3.4.2.2 色谱测定

先将激发波长和发射波长分别调节在300 nm和320 nm,狭缝宽度簇10 nm。设置合理的基线灵敏度，注入适量试样(20uL)，然后观察标准和内标响应峰的强度。若需更好的灵敏度，则进行如下步骤：

在观察检测器吸收响应时，在5 nm以内调节激发波长，以减小本底零值。如上再次进样，确定欲测化合物的信号响应是否增加。按此程序继续选择最佳激发波长和发射波长，直至得到合适的分析信噪比(s/n≥25/1)。

在上述条件下，其保留时间：丙硫咪喹代谢物约4.3min，内标约7.0min。

3.4.3 结果计算

若没有积分仪，则可以用峰高值和峰高比来代替下面所讨论的峰面积和峰面积比。

对于每个试样提取液，HPLC测定所得丙硫咪喹代谢物的峰面积除以内标的峰面积，得到峰面积比。

在直角坐标上，以峰面积比为纵坐标，以对照试样加入标准的ug/kg值为横坐标作工作曲线。根据曲线得回归方程。由回归方程从未知试样的峰面积比按下式直接计算丙硫咪喹代谢物的ug/kg值：

式中：X—待测试样中丙硫咪喹代谢物的浓度，ug/kg;

Y—待测试样提取液的峰面积比；

b—回归方程的截距；

m—回归方程的斜率。

4 方法的测定低限和回收率

4.1 测定低限：25 ug/kg。

4.2 回收率

回收率的实验数据：丙硫咪喹代谢物浓度范围0.05～0.20mg/kg时，回收率为86.9％～93.25％。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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