91．按照2010版药典，做头抱映辛钠的有关物质检测，按要求应该用醋酸调节pH，但加了5滴磷酸，结果不出峰。为什么？

答：调节流动相的pH对HPLC非常重要。因为有些物质对pH很敏感，调节不到位就检测不出来。所以做HPLC的科技工作者，千万要注意流动相调pH的问题。建议严格按照药典的要求或有关标准的规定来调pH，而不是根据自己以往的经验加上5滴磷酸。“5滴”是什么概念？相当于多少mL?搞分析工作的人，应该特别注意重视量的概念。

大家都知道：同浓度的醋酸和磷酸的酸度(pH)相差是很大的，磷酸的酸度要高，我们加5滴醋酸或5滴磷酸，其pH相差会很大。本工作如果不出峰可以先按要求加醋酸，估计问题即可解决。如果不行，建议改变梯度试试，但这样做很可能影响分离效果。

92．进样基线很好，保留时间能锁定，压力也稳定，但是峰面积差别很大，大概有2倍的差别，是什么原因？

答：原因可能是多方面的，建议采用以下方法解决。

(1)调换一根新色谱柱，如果情况一样，则排除柱子的原因。

(2)将在线过滤器拆下，用超声清洗，如果结果一样，说明与在线过滤器无关。

(3)考虑是不是进样阀有问题或定量环堵。建议多进几针样品，看是否有规律，如果没有规律，应该检查一下进样器的其他部位，如果是进样器系统出问题，应该尽快解决之。

(4)对进样器清洗一下，清洗干净后先进一针空白，再进样，看看结果如何，如果有明显减小，那可能就是进样器污染，有样品残留在进样阀体内，在切换的过程中被流动相带入色谱柱。

(5)考虑样品溶液是否均匀。建议同一个浓度连续进样5次，看一下结果如何变化，有没有规律；如果是样品溶液不均匀，可以再搅拌一下。

(6)考虑光源(氘灯或钨灯)是不是正常。应该检查光源能量是否符合要求，是否因为光源的电源出现故障、光源的寿命到期引起了波长位移。

(7)考虑浓度是否在线性范围内。有时候定量时浓度太高或太低都会产生较大的分析误差。

(8)考虑取样方法是否正确，每次取样后是否对针头外面的附着液进行了清除。有时候，这是引起峰面积不重复的主要原因。

(9)仪器的计算机软件编制可能存在问题。对此可以适当改变软件。

如果采取上述办法仍然解决不了，就应请制造厂的工程师来维修。

93．做新品开发时，主峰拖尾严重，应该怎么解决？

答：做新品开发，往往没有成熟的、现成的实验条件。因此，对这个问题我们应该考虑以下方面。

(1)更换新色谱柱。寻找最佳或最合适的色谱柱。

(2)花力气摸索实验条件。主峰严重拖尾的问题应该先从流动相上下工夫。先优化条件，改变流动相组成的比例，在改变流动相比例的实验过程可以采用选择两端和中间的比例，看看哪个效果好。

(3)应该改变pH，寻找最佳的pH。一般是酸性物质拖尾就加少量醋酸，碱性物质拖尾就加少量三乙胺。

(4)增加扫尾试剂。在流动相中加入酸或碱，抑制色谱柱的硅羟基作用，防止拖尾。先换流动相，水相用缓冲盐、醋酸铵或磷酸盐(5mm或10mm)，分别调节pH:酸性，中性，或碱性，直到得到最佳pH为止。

(5)可能是打入大浓度的物质后一直没有洗脱干净，由此形成了主峰拖尾。

(6)流动相不干净，里面有杂质，建议过滤流动相。

(7)注射器有污染，带进杂质，引起拖尾。

(8)系统中有气泡，建议尝试排气。

94．对未知的天然提取物(用石油醚提取桂花得到的提取物)，想要用HPLC(用紫外检测器)分析，但是不知道色谱条件(固定相流动相种类、柱温、流速、检测波长等)，应该如何确定？

答：这个问题比较复杂，不是一个一般的简单分析工作就能确定的，它是一个研究课题。如果未知的化合物条件全部未知，建议不应该首先用HPLC来做，而要先鉴定该物质的结构。如果要用HPLC，是需要自己摸索色谱条件的。有文献的话，还可以在文献基础上优化，没有的话，只有自己摸索。摸索条件虽说并不会特别复杂，但是很费时间，特别是样品处理，更要花精力，首先至少应该确定该物质是否有紫外吸收波长。用HPLC测定未知化合物很难，因为你不知目标物的类型，就没办法确定检测器、色谱柱、流动相。即使你确定了检测器，波长也难确定等。所以建议先上质谱，根据课题目标，大概了解了可能的目标物后再进行下一步的HPLC摸索。

可以先配制0.01m磷酸溶液甲醇(70％：30％)作为流动相；试剂用色谱纯甲醇，分析纯磷酸(含量大于85％)，一次和二次蒸馏水。配置方法：①吸取0.63mL磷酸，用二次蒸馏水溶解并定容至1000mL;②取700mL上述磷酸溶液与300mL甲醇混合，混匀，用0.45gm滤膜过滤、脱气、备用。

如果有条件的话，可以买纯度更高的磷酸，这样对仪器损坏程度较小。

95．是什么原因造成的在做标样的时候出现倒峰？

答：出倒峰很正常，很多都是溶剂峰。比如用紫外检测器的话，如果物质的紫外吸收比流动相弱，就会出倒峰。有气泡、有污染也会出倒峰。出峰较快(3min左右)，倒峰有可能是溶剂峰，如果倒峰时间后滞，有可能为杂质峰。同时，如果色谱柱坏了也会出倒峰。

96. HPLC仪器的评价标准有哪些？

答：这个问题非常重要。很多使用HPLC的科技工作者经常上当受骗，就是因为不会评价HPLC，不知道哪种HPLC仪器好，哪种HPLC仪器不好。所以掌握评价HPLC仪器的方法非常重要。作者积自己长期实践的经验，认为以下几个方面值得注意。

(1)关于评价HPLC的原则、角度、具体方法。

(2)特别要重视可靠性问题(高压泵的稳定性；耐压程度、流速的精确性、检测器的噪声、检测限、色谱柱的分离效率等)，因为它是做仪器和用仪器的生命线。

(3)HPLC的指标分为功能技术指标和性能技术指标两种；功能技术指标是指HPLC的自动化程度，而性能技术指标指的是影响分析测试结果的数据可靠性的指标。所以，应该特别重视性能技术指标；有些外商恰恰相反，他们在介绍或宣传自己的产品时，自觉或不自觉地只宣传功能技术指标，不讲性能技术指标，这是不对的。这是误导使用者的表现。所以，使用者必须要掌握评价HPLC的方法。制造者也应该重视这个问题，否则做出了HPLC仪器，不知道好用与否，这是很悲哀的事。

(4)评价色谱柱主要应该注意以下几个方面：①柱效(理论塔板数)n大者好；②容量因子k'大者好；③相对保留值(选择因子)a大者好；④分离度Rs大者好。一般来讲，为达到好的分离，我们希望n、a和Rs值尽可能大。一般的分离(如a=1.2，R_s=1.5),需要n达到2000。柱压一般为104kPa或更小一些。

HPLC是色谱法的一个重要分支。它采用高压输液泵和小颗粒的填料，与经典的液相色谱相比，具有很高的柱效和分离能力。色谱柱是色谱仪的心脏，也是需要经常更换和选用的部件，因此，评价色谱柱是十分重要的。而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常。

97.一个混合样品是含尿嘧啶 (0.010mg/mL)，萘(0.010mg/mL)、联苯(0.010mg/mL)、菲(0.006mg/mL)的甲醇混合溶液；用HPLC检测(固定波长254nm的紫外检测器)；色谱柱：5cm×4.6mm I.D.，YWC-C18H37(ODS)，10um；流动相：甲醇：水(80：20)。分析测试的全过程应该怎样才是最合适的？

答：这个问题是一个简单的分析测试工作，应该按如下程序操作。

(1)准备流动相。将色谱纯甲醇和色谱纯水按比例配制200mL溶液，混合均匀并经超声波脱气后加入到仪器储液瓶中。

(2)确定电路连接和液路连接正确以后，接通高压泵、检测器和记录仪的电源。设定操作条件为：流速1.0mL/min，压力上限2104kPa(约3000psi)，检测波长254nm,量程(灵敏度)0.2AUFS，记录仪走纸速度1.0cm/min，记录仪量程为5mV。

(3)待基线平稳后，将进样阀手柄拨到“Load”的位置，使用专用的液相色谱微量注射器取5uL样品注入色谱仪，然后将手柄拨到“Inject”位置，同时按一下检测器的标记按钮并计时，记录色谱图。

(4)重复(3)的实验两次。

(5)用同样方法进纯样品的甲醇溶液，确定出峰顺序。

(6)根据三次实验所得结果计算色谱峰的保留时间、半峰宽，然后计算色谱柱参数n，k'，以及相邻两峰的a，Rs。

(7)将流速设置降为0，待压力降为0后关机。

98. HPLC-AFP(原子荧光光度计)联用时，基线噪声很大，原因是什么？怎么解决？

答：噪声大的原因和解决方法如下。

(1)检测器的氘灯能量低、电源纹波太大或光电传感器老化等；需要调换。

(2)色谱柱沾污；需要冲洗。

(3)泵流速不稳，波动大；调节到稳定流速。

(4)高压泵或色谱柱接头等处有漏液；需要拧紧漏液处的接头。

(5)AFP的电光和光电系统的故障，对AFP的电光系统、光电系统等逐项检查；找出产生基线噪声大的具体原因和具体位置并解决之。

工作结束后，用90％甲醇＋10％的水冲洗色谱柱30分钟，最后用纯甲醇冲洗30分钟后关机。

99．调整HPLC的流动相有哪些原则？

答：HPLC的流动相调整非常重要，一般来说，应该考虑以下方面。

(1)由强到弱。一般先用90％的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。

(2)三倍规则。每减少10％的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。

(3)粗调转微调。当分离达到一定程度后，应将有机溶剂10％的改变量调整为5％，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。

(4)液相色谱是样品组分在柱填料(固定相)与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此，还要求流动相具备以下的特点。

①流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

②流动相与样品不产生化学反应。

③流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

④流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

⑤流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

⑥流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

100．选择HPLC的色谱柱有哪些关键问题？

答：这个问题很重要。一般来讲，选择HPLC的色谱柱，应该考虑以下方面。

(1)我们应该根据样品的极性、样品的性质选择合适的柱子，确定是选反相柱，还是选正相柱。一般极性很小的或者怕水或醇类，可选正相柱，反之则可选反相柱。一般反相色谱柱要比正相色谱柱的应用更加广，并且流动相便宜。

(2)要考虑以下几种情况；①根据样品的性质(是酸还是碱)来选择酸性柱还是碱性柱。②根据样品的极性，先从高有机相含量开始试，逐步减少流动相，直到满足你的分离要求。或者先走一个梯度，根据梯度洗脱的效果来定流动相的比例。个人建议对化合物极性摸不准时，用梯度摸索效果比较好。③如果经常要摸索方法，检测器最好配DAD检测器，可以进行全波段扫描以及进行峰的纯度检测。

101．为什么会出现负峰？怎么解决？

答：出现负峰，可能是连接数据处理系统信号线接反了；或进样器注射进入了空气；或者使用的流动相具有高吸收系数；有时也可能是色谱柱出现了故障(性能下降)。

102．有使用者同时买了同一个公司生产的同一个型号的两台HPLC(A和B)；验收时发现两台仪器的峰形不同；工程师检测结果显示仪器指标都合格，这是为什么？怎么解决？

答：这个问题必须从仪器学角度看，并且用仪器学理论来解决。仪器指标都合格，可能是对的：但是二者峰形不同可能也是正常的，这里与色谱柱有密切关系；因为色谱柱的填料千变万化，颗粒大小、杂质情况、塔板数等稍有不同，就可能产生峰形有异。测试时流动相的流速稍有差别，也可能影响峰形。

解决办法：以A台仪器为参照，将A台仪器的色谱柱换到B仪器上，采用同样方法测试，两台仪器的谱图就会一致了。

相关链接：HPLC仪器实践中具有实际使用价值的100个问题（九）