81. HPLC在制药领域的应用主要有哪些方面？

答：因为HPLC具有高效(高速)、高分离效率、高灵敏度、高自动化程度等特点，所以它作为一种分析方法，已被广泛用于各个领域，己经成为常规分析手段之一。HPLC在制药领域的应用非常广泛，中国药典和许多国家的药典，都明确规定很多药物的分析检测、质量控制必须用HPLC。中国的2010版药典新增用HPLC做质，控制的药物达到900种之多；各种药物，特别是中药，属于复杂体系，对这种复杂体系的分离、纯化，HPLC是首选。所以，在药物分离、药物纯化等工作中，HPLC的应用更为广泛。目前，HPLC已成为新世纪中药物分离技术、纯化技术发展的主流。药物与人类的健康、生活质量的提高关系极大，许多药品由于受到纯度的影响，药效不能充分发挥，甚至产生毒物副作用引起过敏，给患者带来生命危险；有些药物服用前需做各种试验(如青霉素等)，非常麻烦。外消旋体药物就是最典型的例子之一。它由左旋与右旋两种光学异构体组成，不同的异构体药理与疗效完全不同。以往由于分离与纯化能力的限制，市场上常以混合物(即外消旋体)形式出售。即使有少量的药物经过纯化分离后出售，价格也极为昂贵。目前美国FDA(食品和药品管理局)和西方许多国家的有关部门都己做出了禁止外消旋体药物在市场上销售的决定，必须把它分离成单一的左旋或右旋体才能作为产品上市。所以药物产品对分离与纯化技术提出了更高的要求。而HPLC是药物分离、纯化中的最有效的技术手段之一，是目前国内外使用最多的药物分离、纯化技术。

制药厂需要拿到合格的药品，因此对制备型的HPLC很感兴趣；目前的制备型HPLC的色谱柱的直径已经由几毫米发展到几十厘米，目前最大的制备柱已超过1m。为了提高生产效率，通常制备型的HPLC色谱柱长仍保持在25厘米左右。随着色谱柱径的增大，分析用的空管柱已达不到很高的柱效，柱结构也随之发生了变化。目前，直径大于5厘米的色谱柱通常有径向压缩、轴向压缩及环状压缩三种结构，尤其是轴向压缩(dynamic axial compression, DAC)柱的使用最为普遍。主要生产商有NovaSep,DanPrOcess和Merck等公司。填料的颗粒及大小也由经典的无定型大颗粒(40～60um或更大)发展到目前的球形高效细颗粒(10～20um),填料和分析用的填料十分相似。无定型填料虽便宜但柱效不高，而且在大流量流动相的冲刷下极易破碎、生成细末，不但使柱压升高，而且易堵塞滤片，甚至发生污染。此外，粒径减小有利于柱效的提高。以往认为“制备色谱不需要高效柱”的观点是完全错误的。新一代大规模HPLC正在采用与分析柱相似的填料，而且柱效十分接近，有时由于大直径减弱了柱内的管壁效应，甚至可以得到高于分析柱的柱效。大规模HPLC中的填料要求机械强度高，化学稳定性好，孔径的分布和粒度分布要均匀。适合于此类要求的填料有Kromasil, Zorbax等，而且对每批产量有一定的要求。瑞典Eka-Chemicals公司的生产Kromasil每批可高达120kg，完全能把分析柱上的非线性色谱优化条件放大为工业生产并得到同样的结果。除了对各种光学及空间异构体的分离外，无论在天然药物，还是生物技术生产的各种生物药品的开发、分离和纯化上，HPLC都发挥着其他技术无法比拟的威力。国外已经发展到年产量从几百千克到几十吨的、规模不同的HPLC工业化分离纯化药物的“绿色”生产线。从原料的投入到杂质与纯品的分离、收集、流动相及其他溶剂的回收全部自动化，而且几乎达到了零排放的标准。尽管HPLC有极大的分离能力，但它也不是万能的。对于目标产物浓度很低、干扰物很多、特别复杂的体系，如生物技术产品的分离与纯化，通常仍需与其他常规分离技术配合，进行原料的前期处理或初步分离，而只把HPLC技术用作成品的最终纯化步骤。此外，HPLC还是一种高投入的分离技术，迄今为止，主要使用在分离与纯化高附加值且纯度要求高的产品，因而在生物技术和制药业中发展尤为迅速。

特别是随着HPLC与MS(质谱)联用(LC-MS), HPLC与AAS(原子吸收分光光度计)联用(LC-AAS), HPLC与AFP(原子荧光光度计)联用(LC-AFP)等技术的迅速发展，使得HPLC在药物领域的应用大放光彩。我们有理由坚信，HPLC在制药领域的应用将越来越多，HPLC对制药领域的贡献会越来越大。在21世纪，HPLC技术由于具有其他方法无法比拟的特点及强大的分离能力，必将成为新药开发、各类药物的分离与纯化领域中的主要方法之一。它将会发挥出更大的作用，将为人类的健康与长寿做出更大的贡献。

一般药厂大多使用HPLC来测量药物成分含量是否正常(也就是质量检验)；一种药剂常含有多种组分，而HPLC是一种既能分离又能定量的有效方法。利用它还可以了解监控药物生产过程中主体和副产物的存在情况以保证药物生产的质量。

高效液相色谱法(HPLC)作为一种分析方法已被广泛用于各个领域，成为常规分析技术之一，有的已被列入药典，成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。HPLC在分离纯化技术中的应用无疑是大规模的，并且将会越来越多。在各类工业化的大生产中，HPLC只是近十几年来才得到了较大的发展，但是今后它将得到飞速发展。与传统的分离纯化方法相比，HPLC的高效、快速及自动化的操作，引起了各领域尤其是食品、制药业的广泛关注。

82. HPLC出峰顺序应该与样品组分的极性大小有关，但是分子量会不会影响出峰顺序呢？到底是大分子量的组分先出，还是分子量小的先出？

答：这个问题应该从色谱理论上解释。

跟色谱柱和样品的极性有关系，一般来说，有机物分子量、聚合度越大，极性越低。正相柱先出极性强的，反相柱先出极性弱的。不同的色谱柱出峰顺序有时会不一样，一般应该是小分子的组分先出来，这跟色谱柱和样品的极性有关系。一般有机物分子量、聚合度越大，极性越低，所以一般可能是小分子量先出峰。但是不同柱的分离原理不同，大致来说，出峰次序先后和与柱的亲和力大小是负相关的。

反相是极性强的先出，正相是极性弱的先出；保留强的后出，保留弱的先出。而保留的强弱取决于目标物在流动相和固定相之间的分配比例。

同时出峰顺序和色谱柱本身有关，一般分子量小、与色谱柱亲和力差的先出，其余的后出。这个应该和分析样品的极性相关，如果极性相同，分子量小的先出。

在通常的正相液相分离(硅胶作为固定相)中，化合物的极性越小、保留值越小，出峰越快；同时，其还受到空间效应的影响。在反相液相分离(C8、C18作为固定相时)中，洗脱顺序正好相反。

83．上午用HPLC测样品，情况正常，下午将流动相调换一下，结果出现了很多小倒峰，这是什么原因？

答：这个问题产生的原因有以下可能：①换流动相时管路里带进了气泡；②上午的流动相与下午换上的流动相发生了化学反应或流动相混合时产生了气泡；③流动相超声时间不够；④流动相进入仪器后，高压下同时又产生微小的气泡等。所以，建议从这四个方面考虑解决问题。

84．世界上第一台液相是哪个公司生产的？

答：这个问题有很多说法，归纳起来大致如下：从俄罗斯植物学家米哈伊尔·特斯维特最早使用层析技术算起，刚好过了一个世纪。但20世纪60年代末科克兰(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath )、莆黑斯、里普斯克等才开发出了世界上第一台HPLC仪器二他们开启了HPLC的新时代。HPLC使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高了色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作能够在几个小时甚至几＋分钟内完成。

到了20世纪70年代，人们开始认识到HPLC是一项非常有效并可广为应用的分析和制备技术，随后，该项技术本身也不断得到发展。可以说，世界上第一台液相色谱仪器不是一个人或一个公司发明的，而是由几个学者共同发明的。直到后来才出现专门制造液相色谱的公司。

1971年，科克兰等出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着HPLC正式确立它在分析领域的地位。在此后的时间里，HPLC成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物技术、医学、药物的开发与检测，在化工、食品科学、环境科学、商检和法检等方面都有广泛的应用。HPLC同时还极大地推动了色谱柱的固定相材料、检测器技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。

20世纪60年代之前，使用的填充粒大于100um，提高柱效面临着困境，后来的研究人员便采用微粒固定相来突破这一瓶颈。科克兰、荷瓦斯制备成功了薄壳型固定相，这种固定相在玻璃微球表面具有多孔薄壳，实现了高速传递，为HPLC技术的发展奠定了稳固的基础。随着填料粒径的降低，更高的柱效也得以实现。20世纪60年代研制出的气动放大泵、注射泵及低流量往复式柱塞泵，对HPLC的发展起到了推动作用。但它的脉冲信号很大，难以满足HPLC的要求。70年代，往复式双柱塞恒流泵解决了这一问题。

70年代后期，科克兰制备出全多孔球形硅胶，平均粒径只有7 um，具有极好的柱效，并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键合固定相使柱的稳定性大为提高，也使柱的多次使用成为可能。1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动相的组成是提高选择性的关键。

在仪器发展方面，HPLC的第一个雏形是由斯坦因(Stein)和莫尔(Moore)于1958年发展起来的氨基酸分析仪(AAA)，这种仪器能够进行自动分离和蛋白质水解产物的分析。由于这种研究的重要性，别的研究者也被吸引来进行这一方面的重要课题的研究，最终直接促成了HPLC方法的建立。在此期间，哈密顿(Hamiton)在柱效率和选择性方面的成就使他的工作特别有价值。20世纪60年代早期的相关进展是莫尔(Moore)发展起来的凝胶渗透色谱(GPC)。不久以后，沃特斯(Water)有限公司制造了商业GPC仪，这种仪器经过微小的改进之后可用于HPLC分离。在1968～1971年，第一台普通适用的HPLC商业系统推出了。这种新的色谱仪是由科克兰(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯(Preiss)和里普斯克(Lipsky)等研制发明的。

在HPLC仪发明之后，世界上许多HPLC研究小组也随之成立起来。在技术的改进上，各个研究小组能够迅速地交换信息。1969年1月，在美国拉斯维加斯召开了第五届国际色谱进展讨论会，这是HPLC工作者第一次聚会，各种有关信息的广泛交流使得这次会议成为一个激动人心的事件。这次大会的大多数论文收集在当时被称为《气相色谱杂志》(Journal of Gas Chromatography) 1969年上卷。接下来的几次会议的部分或全部内容都与HPLC有关。

HPLC(high performance liquid chromatography)也叫高压液相色谱(high pres-sure liquid chromatography)、高速液相色谱(high speed liquid chromatography)、高分离度液相色谱(high resolution liquid chromatography)等。使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动。由于被测物种的物质不同与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。HPLC作为一种重要的分析方法，广泛地应用于化学、生物、制药领域的分析中。HPLC从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。

世界上第一台商用的液相色谱仪是由SSI(美国科学系统公司)生产的；SSI公司(美国科学系统公司)是首批高效液相色谱系统商品化的专业制造厂商。SSI在1967年生产了世界上第一台液相色谱仪，至今已有40多年的历史(于世林编著，《高效液相色谱方法及应用》(第二版)，化学工业出版社，2005)。

85. HPLC出现基线突然上跳和下跳现象，没有规律，应如何处理？

答：这种现象要看具体情况：如果一开机基线就如此跳动，并且检测器显示的数据正常，就应该检查一下HPLC检测器后部与色谱工作站的连线。如果开机后工作正常，但是工作一段时间后开始基线跳动，有可能是外界干扰，也可能是由于发热等因素引起的故障。这时可以检查周围环境的千扰情况，如电磁场干扰、振动干扰等；检查HPLC检测器后部的与色谱工作站的连线、检测器的氘灯寿命、流动相中有没有气泡等。

86. HPLC中的反相色谱法是什么意思？

答：这个问题要从色谱理论考虑：反相色谱就是使用中流动相的极性高于柱子的极性。一般柱子填料是长链烷基键合，流动相使用甲醇乙腈水等极性流动相。典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相常用十八烷基(ODS或C)键合相等；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，由弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。回答这个问题可以从三个方面考虑。

(1)分离机制。反相键合相表面具有非极性烷基官能团及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多少视覆盖率而定。下面简要介绍疏溶剂理论。

疏溶剂理论是指：当一个非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时，相互产生斥力，自由能(G)增加，熵减小，不稳定性增加。根据热力学第二定律，系统由不稳定到稳定是自发的，即嫡增加是自发的。因此，为了弥补熵的损失，溶质分子中非极性部分结构的取向，将导致在极性溶剂中形成一个“容腔”，这种效应称为疏溶剂或疏水效应。该理论认为，在键合相反相色谱法中溶质的保留主要不是由于溶质分子与键合相间的色散力，而是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合，且缔合反应是可逆的。容量因子k与自由能变化△G的关系如下式：

Ink=InV/V-△G/RT

式中，R为理想气体常数；T为热力学温度；V是色谱柱中键合相表面所键合的官能团的体积；V是色谱柱中流动相的体积。该式说明△G越大，被分离组分的k越小，保留时间越短。

(2)流动相的极性与容量因子的关系。流动相的极性增大，洗脱能力降低，溶质的k增大，t增大；反之，k与t减小。分离结构相近的组分时，极性大的组分先流出色谱柱。

(3)反相色谱法的特点。反相色谱法是应用最广的色谱法，主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物，因为键合相表面的官能团不流失，溶剂的极性可以在很大范围内调整，因此应用范围很宽。由它派生的反相离子对色谱法与离子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合物。用反相液相色谱法，可以解决80％左右的液相色谱课题。因此，必须给予反相色谱法足够的重视。对于结构异构体等难分离物质的分离，则应选用吸附色谱法。

87．流动相有几个组成部分？只有蒸馏水和HPLC专用甲醇两个吗？还是有更多？

答：流动相的组分很多，蒸馏水和甲醇只是最常用的HPLC流动相组成部分之一，其他很多液体都可能被用作流动相，还有很多典型的有机流动相组分等。例如，甲醇、乙腈、四氢呋喃等很多种有机溶剂都可能会用到。

一般情况下，反相柱用甲醇／乙腈／水体系做流动相的比较多，还有异丙醇等。用作流动相的水，一般要求纯水，试剂一般要求HPLC级。水相里还经常会用到缓冲盐、磷酸等控制流动相的pH范围。正相柱一般用正庚烷、正己烷等作为流动相。流动相配好后一定要过滤，以免杂质颗粒损伤仪器和柱子。

88．清除泵内的空气。请问脱气处理如何进行？

答：清除高压泵内的空气要注意按以下程序进行：先打开排空阀(排空阀打开后，流动相不经过色谱柱)，将流速设为8～10mL/min，在这种流速下泵内的气泡可被直接排出，必要时用注射器进行抽打，然后将流速设为2mL/min，观察出液口，如果流动相均匀连续滴下，说明泵头气泡己排出；如果不均匀或时断时续，说明还有气泡，再重新进行。结束后，将阀关闭。

89．现有两根Waters的色谱柱子，一根是Nova-Pak CNHP60A，一根是Nova-Pak Silica，想用Silica色谱柱测定左旋肉碱的量，流动相准备用乙腈和柠檬酸缓冲液，合适吗？应该如何清洗色谱柱？

答：是否合适，要经过实验才能下结论。

冲洗色谱柱是很值得重视的问题，可以先用纯水冲洗，然后用甲醇最后保存在甲醇中。也可以用水和甲醇冲洗，再用甲醇保存。也可以用同样比例的水代替柠檬酸冲洗柱子，然后继续用有机相冲洗柱子再保存。还可以用水与甲醇的混合液清洗色谱柱，最后用甲醇冲洗色谱柱后保存。也可先用90水：10乙腈洗半小时，流速1.0mL/min；再用100％乙腈洗半小时就可以了。请注意：用缓冲盐，一定要做好柱子的清洗工作，否则会带来很大的麻烦，甚至损坏色谱柱。这个工作还可以在做完样品后，将缓冲盐换作水，即用14:86的水冲洗3。分钟，然后用100％的水冲洗30分钟，最后用100％的甲醇冲洗30分钟。

90．在做HPLC时基线很粗，怎么办？

答：这个问题比较复杂，需要考虑的方面也较多，主要如下。

(1)应该首先检查仪器的噪声，如果噪声大，会引起基线变粗，需要采取措施降低噪声；如果基线粗是因为噪音大引起，要解决这个问题就要看你的监测器和工作站的指标以及压力是否平稳，然后可以通过脱气等一系列的方法降低噪声。

(2)调节你的电脑的分辨率。如果分辨率太低，调节一下就会见效。

(3)还有可能是采样频率高。将检测器的狭缝宽度设置得小一点，可能很快就能解决问题。

(4)如果是工作站的坐标太大，调节一下，将坐标设置小点就可能解决。

(5)有可能是光源(氘灯、钨灯)用久了，能量不足引起，这样的话应该调换光源。

(6)电源的纹波太大，也会引起基线变粗，这个问题很多科技工作者不大注意，所以还应该仔细检查光源的电路。

(7)光路通道有污染或流动池污染。如果这样，就要清洗光路通道中的光学组件，或者清洗流动池。

(8)可流动相中有气泡，应该认真排气。

(9)如果确定不是色谱系统的原因，就有可能是电源接地的问题，将检测器外壳、接收装置外壳和电脑的外壳等用电线连起来，认真接地。

相关链接：HPLC仪器实践中具有实际使用价值的100个问题（八）