71. HPLC的基线不稳定(上下波动或漂移)的原因是什么？如何解决？

答：HPLC经常会出现基线不稳定(上下波动或漂移)。积作者之经验，主要原因和解决方法大致如下。

(1)高压泵的单向阀堵塞引起基线波动；解决方法：取下单向阀，用超声波在纯水中超2。分钟左右，去除堵塞物。

(2)流动相中有溶解气体引起基线波动；解决方法：用超声波脱气15～30分钟或用充氦气方法脱气，一般可以解决。

(3)高压泵密封垫损坏，造成压力波动，引起HPLC的基线不稳定；解决方法：更换高压泵密封垫。

(4) HPLC的高压泵或色谱柱存在漏液点；解决方法：查找和确定漏液的位置，有的放矢地解决。

(5)色谱柱因种种原因产生气泡；解决方法：在检测器的流通池的出液口加负压调整器。

(6) HPLC检测器的波长设置不合适，没有设定在最大吸收波长处引起基线不稳定；解决方法：将检测器的测试波长调整至最大吸收波长处。

(7)色谱柱没有平衡好，有时色谱柱的平衡时间要求很长，特别是流动相调换或发生变化时，色谱柱的平衡时间需要较长，在没有平衡前，HPLC的基线肯定不稳定；解决方法：用中等极性的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10～20倍床体积的新流动相对柱子进行冲洗。

72. HPLC的泵、柱接头处为何经常漏液？如何处理？

答：这个问题是HPLC工作者经常碰到的问题，解决办法可以考虑以下方面：如果色谱柱接头没有拧紧，可以拧松后再紧，拧紧接头以手紧为限，不要使用工具；对不锈钢接头一般先用手拧紧，再用专用扳手紧1/4圈左右。如果接头被污染或磨损导致漏液，建议更换接头；如果使用的接头不匹配(特别是卡套)，建议使用同一品牌的配件。

73. HPLC的进样阀漏液是如何造成的？应该如何解决？

答：HPLC的进样阀有时容易漏液，对使用者来说是一个头痛的问题。发现进样阀漏液，可以考虑从以下方面分析和解决。

(1)定量环阻塞(一般比较多见)；解决方法：清洗或更换定量环。

(2)转子密封损坏；解决方法：更换转子密封垫。

(3)进样口密封垫松动(也较多见)；解决方法：拧紧松动处。

(4)进样针头尺寸不合适(过短或过长)；解决方法：使用恰当的进样针(注意针头的大小和形状)。

(5)有时废液管中产生虹吸；解决方法：清空废液管。

74．造成HPLC色谱峰分叉的原因是什么？如何消除？

答：HPLC的峰分叉是一种常见的现象，使用者碰到此类问题后，应认真解决。

(1)保护柱污染经常会导致峰分。解决方法：取下保护柱再进行分析；如有必要则更换保护柱。

(2)如果分析柱阻塞或污染，就应该认真清洗。

(3)如果分析柱被强保留物质污染，则可运用适当的再生措施清除强保留物。

(4)色谱柱的入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。

75．使用者感到HPLC灵敏度不够的主要原因是什么？如何解决？

答：HPLC使用者在分析工作中，经常会感到仪器的灵敏度不够，一般应该从以下几个方面考虑。

(1)不是仪器灵敏度不够，而是样品浓度不够(样品量不足)；解决办法是增加样品量。

(2)样品未进入检测器，因为可能是样品没有从色谱柱中流出或者只是部分流出，所以，经常被误认为是HPLC的灵敏度不够；解决方法：可根据样品的化学性质改变流动相组成或pH;或者调换色谱柱。

(3)仪器条件设置不合适，检测器波长等不是最佳值；解决方法：根据样品在光谱仪器上扫描得到的吸收峰，调整检测器的测试波长或改换非选择性(通用性)检测器。

(4)检测器衰减太多；解决方法：调整检测器的量程，减少衰减。

(5)检测器时间常数太小；解决办法：增大时间参数。

(6)检测器流动池窗片污染；解决办法：用较大极性的流动相清洗流动池窗片。

(7)检测器流动池中有气泡；解决办法：用大流量的流动相冲洗流动池排气。

(8)记录仪灵敏度范围设置不当；解决方法：调整记录仪的量程设置。

(9)流动相流量太快；解决方法：调整流动相流速到合适程度。

76．日常应如何预防HPLC高压泵的故障？

答：HPLC高压泵是一个很容易出现故障的部件，使用者应该注意预防高压泵的故障。为了保持高压泵的良好工作性能，必须注意它的清洁、保证溶剂和试剂的质量、对流动相进行过滤和脱气等。作者认为以下几个方面应该引起使用者的重视：①认真阅读有关高压泵的操作手册和其他有关的建议，严格按操作手册操作；②注意使用高质量或HPLC级的溶剂；③过滤流动相和溶剂；④注意流动相脱气；⑤每天开始使用时先放空排气，工作结束后从高压泵中洗去缓冲液；⑥不让水或腐蚀性溶剂滞留高压泵中；⑦定期更换密封垫圈；⑧需要时应该在高压泵的移动部分适当加润滑油。

77. HPLC系统使用中最常见的故障有哪些？其解决方法如何？

答：能正常工作的HPLC系统应该包括贮液瓶、高压泵、进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、数据处理系统等。一般来说，高压泵、色谱柱和检测器是核心部件，是最容易产生故障的主要部件。所以，讨论HPLC最常见故障时，应考虑以下几个方面。

(1)高压泵的故障。高压泵的故障除了直接反映为高压泵工作不正常外，一般还反映在色谱柱的柱压上(色谱柱压出现故障因素较多，前面已经讨论过)。有时如果高压泵里进了空气，此时表现出的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3～5mL/min的流速冲洗；如果不行，则要用专用针筒在排空阀处往外将气泡吸出。一般来讲，如果高压泵的流量或压力波动，说明高压泵出现了故障，应该根据本书第8章维修解决。

(2)色谱柱的故障。色谱柱压的稳定性与色谱图的峰形的好坏、柱效高低、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指色谱柱压力绝对稳定在一个恒定值，而是指压力波动范围在50psi(3.3bar)左右(在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢地变化是允许的)。色谱柱压故障问题，有可能是高压泵引起的；一般色谱柱压力升高，指的是压力突然升高，主要是由于流路中有堵塞。此时，我们应该分段进行检查。

①断开泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30％的硝酸浸泡半个小时，再用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，则说明溶剂过滤头正常，再检查。

②打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10％的异丙醇超声半个小时。

③把色谱柱出口端断开，如果压力不下降，则是色谱柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95％的水冲至压力正常；如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将色谱柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换色谱柱子入口筛板。这一步骤一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。

④色谱柱压力过低的现象一般是由于系统管道漏液；解决方法：查看高压泵、色谱柱和检测器之间的各个接口处，特别是色谱柱两端的接口处，检查是否漏液；如果漏液，则把接口处漏液的地方拧紧、把管道漏液处拧紧或调换管道。

⑤基线漂移。一般说来，机器刚启动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，才能稳定。如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，或在低波长下(如220nm左右处)，平衡时间相对会比较长。但如果你在工作过程中发现基线漂移，则需要考虑以下方面。

a．色谱柱温波动引起基线漂移；解决方法：控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。

b．流通池被污染或有气泡引起基线漂移；解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池(最好断开柱子)。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用盐酸)。

c.氘灯寿命到期，能量不足产生漂移；解决方法：更换新的紫外灯。

d．流动相污染、变质或由低品质溶剂配成；解决方法：检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂，最好用HPLC级的溶剂。

e.样品中有强保留的物质(高K')以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线；解决方法：使用保护柱，如有必要，在进样分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。

f．检测器没有设定在最大吸收波长处；解决方法：将波长调整至最大吸收波长处。

g.流动相的组成不合适或pH没有调节好；解决方法：重新配置流动相；加适量的酸或碱调至最佳pH。

⑥保留时间漂移。保留时间的重现性是否好，是HPLC性能好坏的一个重要标志。同一种样品，两次的保留时间相差不要超过10s，如果保留时间相差超过了20s,可认为HPLCd保留时间漂移。此事无法进行定性，应该考虑以下几个方面。

a．温控不当。解决方法：调好柱温，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。

b．流动相比例发生变化。解决方法：检查四元泵的比例阀是否有故障。

c．色谱柱没有平衡。解决方法：在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。

d．高压泵中有气泡。解决方法：从泵中除去气泡。

e．流动相的流速变化。解决方法：重新设定流速。

(3)峰型异常问题。HPLC的峰型问题是最主要的问题；在使用HPLC的过程中，我们经常要变换不同的条件来改善不好的峰型。对于各种各样的异常峰，我们应该区别对待，一般应该考虑以下几个方面。

①色谱图中未出峰，可能是系统未进样或样品分解；高压泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确。解决方法：根据相应问题，认真进样、查看高压泵的工作质量或重新设置合适的检测器工作波长。

②一个峰或几个峰是负峰，可能是因为流动相吸收本底高、进样过程中进入了空气、样品组分的吸收低于流动相。解决方法：调整流动相、排除空气。

③信号线接反或检测器输出极性设置颠倒，或系统的光电部件预热时间太短，或色谱柱尚未达到平衡，会导致所有色谱峰均为负峰。解决方法：针对具体问题，找出原因，予以解决。

④系统未达到平衡，溶解样品的溶剂极性比流动相差很多，色谱柱尺寸及类型选择不正确，色谱柱或保护柱被污染或柱效降低，温度变化造成的影响等，都会导致所有峰均为宽峰。解决方法：正确选择色谱柱、冲洗色谱柱、调整温度。

⑤样品黏度过大，进样品故障或进样体积误差，检测器设置不正确，定量环体积不正确，检测池污染，检测器灯出现问题等，会导致色谱峰比预想的小，分析测试数据偏低。解决方法：针对各项具体问题找出原因，予以解决。

⑥进样量过大，样品浓度过高，保护柱或色谱柱柱头堵塞，保护柱或色谱柱污染或失效，柱塌陷或形成短通道，会导致出现双峰或肩峰。解决方法：针对各项具体问题找出原因，予以解决。

⑦进样量或样品浓度高，溶解样品的溶剂较流动相极性强，保护柱或色谱柱污染或失效，会导致“前伸峰”。解决方法：针对各项具体情况找出原因，予以解决。

⑧进样量太少、样品太稀、存在杂质干扰峰、流动相的pH不合适、柱效下降等，会导致峰拖尾。解决方法：增加进样量、增加样品浓度、对样品进行清洁过滤；调整流动相的组分或pH；尽可能使用内径较细的连接管；更换新色谱柱子；采用保护柱等。

⑨检测器的设置(波长、衰减等)不正确、进样体积太大或样品浓度太高，会导致出现平头峰。解决方法：重新设置检测器的参数、改变进样量或调整样品浓度。

⑩进样阀中残留样品，流动相污染，每次进完样后没有用足够的时间来平衡和清洗系统，流路中有小的气泡，样品中存在未知物等会导致出现鬼峰。解决方法：清洗进样阀；每次进完样后坚持用足够的时间来平衡和清洗系统；改进样品的预处理；更换新的流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；排除气泡。

(4)检测器故障。HPLC的检测器属于光机电计算机四位一体的关键部件；如果发生故障，应该根据仪器学理论，检查电光源系统、光学系统、光电系统、电子学系统等各个关键模块的有关部分。请参考本书的维修保养的有关章节。

HPLC是一种高科技产品，影响使用的因素多，用好的难度大，对使用者要求高，所以HPLC的使用者要认真研究如何用好仪器。本题只是对HPLC中出现的常见的部分故障进行了讨论。在解决HPLC故障的时候，作者在总结自己的经验和教训的基础上，建议有关HPLC的使用、维修人员遵守以下原则：分段检查、分段解决、一次只改变一个因素，每次都应认真确定假定因素与故障之间的联系；如果需要更换组件来排查故障，则要注意将拆下的完好组件装回原位，避免产生新的故障。这些方面是成功排除故障的关键。总之，在使用高效液相色谱时一定要注意样品的前处理与仪器的正确操作和保养。

78．开机后，用甲醇1.0/min的流速冲洗了50分钟，期间一切都正常；然后换新的流动相冲洗(0.1％磷酸溶液，乙腈=75 : 25，已经过滤、超声；250mm的迪马C18柱)，开始系统正常，30分钟后压力显示为0，为什么？

答：这种现象作者碰到过，其原因可能是多方面的，应该全面分析，建议采用以下办法。

(1)关闭高压泵，打开排空阀快速排空看结果。

(2)最大的可能是单向阀堵塞。建议用5％的磷酸溶液，多超声几次单向阀。

(3)高压泵中可能有气泡，可以用仪器附带的专用注射器辅助抽气。

(4)有机相和缓冲盐更换时会有发生阀堵塞，可以把入口主动阀也拆下来超声一下，看看有没有改善。

(5)仔细查看泵里面是否空了、泵里有没有液体流出来。可以用针筒抽抽看泵里是否空了。

(6)最重要的是流动相一定要用0.45um的滤膜过滤，否则杂质卡在高压泵的红宝石和进液口处，很容易导致无压力。

(7)高压泵的硬件是否有问题，应该详细检查，认真排除。

如果采用以上办法还是解决不了问题，就应该请制造商的工程师来维修。

应该指出：开机后，用5％的甲醇水溶液对系统冲洗30分钟左右，再换入所需要的流动相的做法不妥。不必用甲醇冲洗那么长的时间，因为甲醇的作用是为了使色谱柱保存在纯溶剂里不至于干裂损坏。如果用甲醇冲洗色谱柱子，根本洗不掉污染物。

79．用HPLC做了血药样测定，仪器正常。但是仪器停用了将近两个月后再用，还是同样的仪器条件，结果色谱柱子的压力由原来的140bar左右骤升至310bar左右，为什么？

答：因为检测的血药样品属于高杂质的样品(血药浓度测定时样品可能含有盐类杂质)。所以，这个问题很可能是色谱柱堵塞了，作者建议采取以下办法解决。

(1)调换其他色谱柱，看是否是色谱柱有问题。

(2)如果是色谱柱堵塞了，可以断开检测器，反向冲洗色谱柱子。可以先用95％的水冲洗，再用异丙醇冲洗(可用0. 5mL/min流速，冲洗1小时左右)。

(3)反冲洗的效果如果不明显的话，只能拆开色谱柱，看看是不是柱筛板堵了，如果不是，可把表面的填料挖去一点。但是这样做可能会影响保留时间。

(4)可以先拿掉柱子设流速，再看压力，这时压力一般会很低。

(5)采用低流速、低有机相(0.5mL/min左右的流速，5％的有机相)冲洗色谱柱，看是否有改善。

(6)可能是样品前处理不好，可以用二氯甲烷等强极性溶剂冲洗一下柱子，注意冲洗的时候流动相用异丙醇做过渡，还应注意压力。

(7)如果压力仍降不下来，建议这根柱不要再用了，长期在高的压力(大于300bar)下工作，对高压泵的损坏很厉害。
80．使用HPLC做一个样品，流动相用甲醇：水＝80 : 20，但峰没有完全分开；仪器的其他条件不变，后来改用甲醇：水＝70：30和85：15都能分开，但又产生峰拖尾现象，这是为什么？

答：样品峰分不开或峰拖尾的现象很多科技工作者会经常碰到，这个问题建议用以下办法解决。

(1)调节流动相的pH，对分不开和峰拖尾的流动相加入缓冲盐或三乙胺等看看效果。

(2)有机相比例大峰形会好，建议在样品中加点普通的缓冲盐，磷酸盐系列可能会有作用；如果加三甲胺，则建议使用极性强点的流动相。

(3)可加适量三乙胺，或更换不同填料的色谱柱。

(4)调节流动相的pH,酸性化合物加酸，碱性化合物可以加三乙氨。有时碱性的化合物也能加酸，峰形也挺好。具体做法可以自行尝试。

(5)消除拖尾的方法较多，如调pH、调节流动相的流速、调节色谱柱的柱温等。

相关链接：HPLC仪器实践中具有实际使用价值的100个问题（七）