现有的λ噬菌体载体及其衍生载体(如Cosmid, phagemid载体)都是以λ噬菌体为基础构建完成的。为了更好地了解λ噬菌体载体及其衍生载体的特点和优越性，下面我们对λ噬菌体特性进行简单地介绍。

(一)λ噬菌体

λ噬菌体是一种以大肠杆菌为宿主菌、具有极强感染能力的病毒。λ噬菌体通常具有溶源和溶菌两种不同的生长途径。在溶源状态下，λ噬菌体能够通过POP’基因的位点专一性重组整合在大肠杆菌的染色体上，以原噬菌体的形式长期潜伏在大肠杆菌中，随着大肠杆菌繁殖进行不断的复制。在一定的条件下，λ噬菌体也能够转入溶菌状态，裂解大肠杆菌完成自我包装过程。

野生型λ噬菌体DNA是一种线状的DNA分子，全长大约为48kb。λ噬菌体染色体上的基因主要包括以下几种。①噬菌体头部合成基因。编码A, W, B, C, D, E, F 7种不同蛋白质，分布在λ噬菌体的左侧。②噬菌体的尾部合成基因。编码Z, U, V, G, H,M, L,K,I,J 10种不同蛋白质。③与λ噬菌体的整合、重组等功能有关的基因，如位于λ噬菌体中部的att, int, gam, red, six基因等。④与λ噬菌体的表达调控有关的基因，如CⅢ、N, CⅠ、cro和CⅡ等位于λ噬菌体右半部分的基因。⑤其他与λ噬菌体合成有关的基因。包括与λDNA合成有关的O, P,S,R基因等。

在上述基因中，有些基因可以缺失但不影响噬菌体的基本功能。因此，在野生型λ噬菌体改造成为噬菌体载体的过程中，大量的非必需区段被剔除。这些缺失的区段包括J基因到N基因之间的区段以及P基因到Q基因之间的区段，这些区段的总长度可以达到20kb左右。由于这些区段的剔除，λ噬菌体载体的可装载外源基因片段随之增加。

野生型λ噬菌体DNA的两侧具有2个黏性末端(由12个核苷酸组成)，称为cos位点。噬菌体侵染大肠杆菌以后，cos、位点能够将线性分子连接成为环状的DNA分子。环状的DNA分子被λ噬菌体头尾蛋白包装形成一个完整的噬菌体颗粒。通常而言，当两个cos位点之间的DNA长度为野生型λDNA分子大小的75％～105％，即36～51kb才能完成上述过程。换而言之，剔除非必需基因后的λ噬菌体载体的可装载外源基因片段一般为8～23kb。

野生型λ噬菌体染色体上还具有大量的限制性内切核酸酶位点，已经知道野生型λ噬菌体上具有50多个限制性内切核酸酶位点。这些限制性内切核酸酶位点也需要剔除才能改造成为基因克隆的载体。有关的具体剔除过程在此不加详述。

除了上述2个改造过程之外，根据基因克隆载体的基本要求，野生型λ噬菌体还需要经过以下改造方能成为可供使用的工具载体(图8-2)。①引入可供筛选的标记基因。常用的标记基因是能够在IPTG和X-Gal存在的情况下的大肠杆菌lac基因，通过α互补现象来确立是否是重组的噬菌体个体。②载体片段的连接。将上述片段按照一定的方向加以连接，然后将载体进行环化，将环化以后的载体转入到宿主菌中进行繁殖。

图8-2已经构建完成的噬菌体载体λTriPx2

(二)Cosmid载体

尽管λ噬菌体载体克隆外源片段的长度可以达到20kb，但是在实际使用过程中最长的片段也只能达到10kb左右。此外，λ噬菌体载体不能够进行大量的扩增和繁殖，因此要获得大量λ噬菌体载体DNA进行基因工程操作很困难。针对这个缺陷，1978年J. Collins和B. Hohn等发展出一种新的克隆载体Cosmid载体。这种克隆载体具有λ噬菌体的优点，同时又结合了大肠杆菌质粒的一些特点(可以在大肠杆菌中繁殖，方便载体DNA的抽提)。这种载体本身含有λ噬菌体的。cos位点以及质粒的一些元件，因此被称为Cosmid载体。

Cosmid载体与λ噬菌体载体和质粒载体相比具有以下特点。

(1) Cosmid载体具有A噬菌体的cos位点，cos位点进行相互连接以后能够像λ噬菌体一样，高效转导大肠杆菌。Cosmld载体进入大肠杆菌细胞以后，由于其装载有外源片段的载体上具有两个cos位点，所以能够实现自身的环化过程。

(2)Cosmld载体上没有λ噬菌体生长的全部必要基因，不能够产生溶菌和溶源周期，因此Cosmid载体不能够产生子代噬菌体颗粒。但是，Cosmld载体可以通过添加头尾蛋白完成包装过程。

(3) Cosmid载体具有质粒载体的自我复制起点ori以及抗生素的标记基因，因此Cosmid载体转化大肠杆菌以后，完全可以像质粒一样在大肠杆菌中进行繁殖。

(4) Cosmid载体往往比较小，能够插入较大的外源基因片段。大多数Cosmid载体的长度小于10kb，按照λ噬菌体的包装能力，λ噬菌体的最大承载外源片段能力为：(105％×48kb)-Cosmid载体的长度。由此可以计算出Cosmid载体可以克隆的外源片段长度为15～145kb。由于Cosmid载体具有大片段克隆能力，所以Cosmid载体往往用于基因组文库的构建，而λ噬菌体载体往往用于cDNA文库的构建(图8-3)。

图8-3商业化的Cosmid载体示意图

(三)噬菌粒载体

除了Cosmid载体以外，在噬菌体和质粒载体的基础之上发展起来的另外一种载体就是噬菌粒(Phagemid)载体。噬菌粒载体与Cosmid载体相比，它们存在许多共同之处。例如，在载体上它们都有抗生素基因、质粒的复制起点等。但也有很多不同之处。

(1)噬菌粒载体的分子质量更小，质粒的大小通常在3kb左右。

(2)复制的方式有所不同。Cosmid载体通过λ噬菌体的Ter体系识别两个cos位点将外源片段和载体包装到噬菌体中。噬菌粒载体在大肠杆菌细胞内按照质粒的方式进行复制。当有辅助噬菌体存在的情况下，噬菌粒的复制方式发生改变，按照滚环的方式进行复制，并包装成为噬菌体颗粒以后分泌出大肠杆菌的细胞。

(3)由于噬菌粒载体与质粒载体十分相似，噬菌粒载体所携带的外源片段可以通过提取质粒DNA以后进行直接测序。相反，噬菌体载体或者Cosmid载体上所携带的外源片段必须经过亚克隆以后才能进行序列测定。

现在已经构建的噬菌粒载体有很多种类，最为常用的是Stragene公司的pBluescript SK(+／-)(图8-4)。pBluescript SK(+／-)具有噬菌粒载体的一些普遍特征：①具有一个抗生素标记基因，用于转化子克隆的选择标记。

②在多克隆位点上分别加入T3和T7启动子，用于定向插入外源片段。同时在多克隆位点中具有M13引物用于外源片段或者基因的序列测定。③分别插入有pUC质粒的复制起点和fl质粒的复制起点。pUC质粒的复制起点能够保证pBluescript在大肠杆菌中按照质粒的复制方式进行复制。在有利于噬菌体存在的情况下，pBluescript能够识别fl质粒的复制起点并分别合成(+／-)单链DNA分子。④载体上的lacZ基因可以保证能够利用蓝白斑筛选的方法筛选pBluescript重组克隆。

图8-4 pBluescript II SK(+／-)噬菌粒(Phagemid)载体示意图

pBluescript载体主要用于cDNA文库的构建和对插入的外源基因进行表达分析。

(四)λ噬菌体载体及其衍生载体的用途

λ噬菌体载体的主要用途是构建cDNA文库或者基因组文库。其主要过程是：某种生物体的某个组织的cDNA分子与λ噬菌体载体相连接，然后通过体外包装，直接转导受体细胞。通过体外转导作用，1ug的cDNA分子可以获得10⁶以上个噬菌斑。这些不同的噬菌体中都携带了一条外源cDNA分子。这个噬菌体cDNA文库就可用于基因的克隆。

利用Cosmid载体构建基因组文库的基本过程如下所述。

(1)载体的制备。由于λDNA上具有cos位点，不同λDNA分子之间能够通过cos位点进行相互连接形成多个cos的联体分子。λ噬菌体中具有一种识别两个cos位点的酶切体系，该系统能够识别具有一定长度的含两个cos位点的λDNA分子，并通过末端酶将多联体的λ分子按照两个cos位点的区段切割成为一个λDNA单位。这种λDNA分子能够在噬菌体的包装作用下包装到λ噬菌体中。

(2)基因组片段的酶切消化。通过琼脂糖包埋的方法获得大片段基因组DNA以后，将这些大片段基因组DNA分子进行随机切割以获得较大片段的DNA分子用于文库的构建。现在比较常用的方法是利用限制性内切核酸酶对基因组片段进行部分消化，如AluⅠ、HaeⅡ, MboⅠ、Sau3AⅠ等。按照这些具有4个碱基识别位点的限制性内切核酸酶，平均每246个碱基就有一个酶切位点，利用这个特点就能够对整个基因组进行随机切割。在实际的运用中，较多选用Sau3AⅠ作为限制性内切核酸酶对基因组进行不完全酶切。由于Sau3AⅠ酶切以后产生GATC的黏性末端，可以直接插入到同尾酶BamHⅠ切割的载体中。

(3)片段的分级。经过部分酶切以后的片段大小不一。由于Cosmid载体的包装能力有最低、最高的限度，因此最好将所获得的片段进行分级处理。一般的方法是将酶切以后的片段与蔗糖进行密度梯度离心，经过一个晚上的超速离心以后，DNA片段按照一定大小与一定浓度的蔗糖成梯度分布在试管中。按照实验设计的需要取出所需密度的蔗糖，然后进行透析处理就可以得到一定长度的酶切基因组DNA分子。

(4)基因组片段与载体的连接。将目标片段的基因组DNA分子与载体片段连接，获得插入片段的载体分子。

(5)遗传转化。将上述克隆载体进行化学转化或者电转化，就能够构建获得某个生物的大片段基因组文库。

一般基因组文库的构建都有相应的试剂盒和操作手册，因而可根据说明书进行工作。

利用Cosmid载体构建基因组文库有很多优点，但也存在不少缺点。随着一些新型方便载体的发展，利用Cosmid载体构建基因文库已不十分普遍，但文库构建的过程是相似的。