(一)人工染色体载体的组成

染色体在真核生物体内能够正常地进行复制、分离和有效地传递。染色体的这些特性可以充分应用到载体的构建中。要构建出可供基因工程操作的人工染色体，需要有行使正常染色体功能所必需的各种元件，主要包括着丝粒、复制起点和端粒等。

着丝粒是细胞有丝分裂中期与纺锤丝微管相结合的部分，牵动染色体有规律地分配到子细胞中。在酵母中每个着丝粒只与一根纺锤丝相连。从已经分离的酵母染色体的着丝粒结构分析发现，酵母的着丝粒由120bp左右的保守序列组成，被称为着丝粒序列。着丝粒序列由3个不同区段组成：第1个区段由8个 PuTCACPuTG组成；第2个区段由78～86个含有大量AT的碱基组成；第3个区段由一段非常保守的26个碱基的核苷酸序列组成，序列为TGTPyTPyTGNTTTCCGAAANNNAAAAA。着丝粒3个不同的区段中富含AT碱基的序列被成功运用到酵母人工染色体的构建。

端粒是确保染色体正常复制和维持染色体长度所必需的元件。真核生物的端粒结构基本相同，大多数是由5～8bp的简单串联重复序列组成的一个蛋白质复合体。在拟南芥的端粒中该序列由CCCTAAA 7个碱基组成。在酵母中端粒的结构由(TG)1～3的基本碱基序列组成。这些重复序列延伸到染色体的末端与蛋白质形成一个复合体。端粒的作用是在端粒酶的作用下以能够与重复序列互补的序列作为引发体，完成染色体的末端复制，同时保证在每一次复制过程中染色体不至于缩短。

复制起点是所有生物进行DNA复制所必需的。对于原核生物来讲通常只有一个复制起点，而真核生物具有多个复制起点。在真核生物中，复制起点识别复合体能够识别复制起点并且能够在起始因子和复制因子的作用下完成DNA的解旋和延伸。就酵母而言，已经发现有能够进行自主复制的DNA序列，含有自主复制序列的环状DNA分子能够进行自主复制。酵母自主复制的起点序列中含有4个不同的复制起点序列区，其中最为保守的一段序列为(A/T) TTTTAT (G/A)TTT (A/T)，这段序列在复制起点序列中高度保守。

(二)酵母人工染色体

1983年Murray等以pBR322质粒为基础，加入酵母的着丝粒、自主复制元件和类似端粒结构的简单重复序列以后，构建了一条大约为10.7kb的环状质粒，成为第一条酵母人工染色体(yeast artifical chromosome, YAC)。随后，科学家又以λ噬菌体为基础，加上酵母的着丝粒、自主复制序列、四膜虫rDNA的末端重复序列及基因TRPI和HIS3，构建了55kb的酵母人工染色体YLP21和YLP22尽管这两个酵母的人工染色体在稳定性上存在一定的缺陷，但是它们为后来YAC载体的构建奠定了重要的基础。到目前为止，已经有多种不同类型酵母人工染色体的质粒构建出来。

图8-5酵母人工染色体载体示意图

酵母人工染色体的最大优点是能够插入较大的外源片段，插入的片段长度可以达到2000kb(图8-5)。尽管YAC具有较大的容量，但也存在一些比较严重的缺陷。①嵌合现象的存在(占全部克隆的40％～60％)。在同一YAC克隆中嵌合两个不连续的大片段，来自不同染色体或同一染色体的不连续的区域，这些克隆很不适合测序和作图工作。②稳定性差。在一些克隆中存在序列重排和插入丢失现象。③插入DNA分离与纯化困难。④转化效率低。这些缺点限制了YAC的应用，科学家开始把眼光转向寻找更好的载体系统。

(三)细菌人工染色体

细菌人工染色体(bacterial aritifical chromosome, BAC)是以大肠杆菌的复制元件为基础构建的一种人工染色体。1992年Shizuya等以E. coli的性因子小F1因子为基本骨架构建了第一个BAC载体pBAC108L，它可以插入达300kb左右的DNA片段。pBAC108L已经具备人工染色体载体的一些基本结构，pBAC108L载体主要包括控制质粒稳定性和拷贝数的4个功能区。这4个功能区分别是：①与BAC复制和分裂有关的基因，parA,parB,parC是parFIA分裂所必需的三个基因，同时parB, parC与质粒的不相容性有关；②复制起点及相关的元件，oriS是RepFIA单向复制子，repE基因编码自oriS起始复制所必需的蛋白质E;③抗生素标记基因，载体上携带的抗生素标记基因为氯霉素抗性基因，是载体的筛选标记；④cosN, IoxP分别来源于λ, P1噬菌体，cosN可以被λ噬菌体的末端酶切开，loxp可由P1噬菌体的Cre蛋白在loxP寡核苷酸存在时切开。这两个位点可作为特定的切点以锚定插入DNA的一端，便于限制性内切核酸酶分析。T7, SP6为RNA聚合酶启动子，可用来制备RNA探针和末端测序以便于染色体步移的研究应用。

pBAC108L的构建完成为细菌人工染色体的进一步完善奠定了坚实的基础，但是pBAC108L也有一些缺陷。主要表现在载体上没有重组子选择的标记基因，重组子的选择必需进行分子杂交才能加以验证。为此，后来的研究者在此基础上做了一些改进。这些改进主要表现在以下几个方面。

(1)增强重组子选择的有效性。重组子的选择基因最开始利用的是lacZ基因，可通过lacZ基因的α互补形成的菌落蓝白色来筛选白色重组子，重组子的筛选更趋于直观、简便。但是由于挑取菌落的工作往往是由机器人来完成，而机器人对蓝斑的蓝色背景不适应，因此后来又发展了一种新的重组子筛选系统。这类重组子筛选系统采用的是正向筛选的方法，在多克隆位点区域利用sacB基因(蔗糖-6-磷酸果糖转移酶)取代已有的lacz基囚。在含5％蔗糖的LB培养基上，sacB基因的催化产物对宿主菌大肠杆菌以及农杆菌是致死的，外源DNA的插入使sacB基因失活，因此重组子能够在5％蔗糖LB培养基上成活，而非插入外源片段的菌落死亡。因此，能够在培养基平板上生长的菌落都是重组的个体。机器人进行挑选重组子时不必进行菌落间的分辨。

(2) BAC的严谨型复制改变为松弛型复制类型。尽管BAC以低拷贝形式存在于宿主菌，有利于重组子的稳定遗传，但是这不利于载体的大量制备给应用上带来不便。为了改进这个缺点，研究者将BAC载体的复制启动子变为可诱导调控的启动子。例如，pYLTAC有个受lacZ控制的、可经IPTG诱导的P1裂解复制子，当培养基中加入IPTG后，pYLTAC由严谨型复制转变为松驰型类型进行多拷贝复制。拷贝数的增加对质粒的制备和载体的纯化十分方便。

(四)穿梭细胞人工染色体载体

BAC载体的构建完成极大地促进了基因组文库的构建、物理图谱的构建、基因的图位克隆和基因结构及组织表达性分析。但是BAC筛选获得的阳性克隆必须经过亚克隆和遗传转化才能验证阳性BAC克隆子是否含有目标基因。为了减少亚克隆和载体构建的工作，Hamilton等在BAC基础上构建了可用于植物大片段转化的双元T-DNA载体BIBAC2。BI-BAC2包含了在大肠杆菌和农杆菌中复制和进行遗传转化的多个元件。

穿梭细菌人工染色体载体(binary bacterium artifical chromosome, BIBAC)包括以下一些元件。①miniF因子进行复制、稳定保持的功能区，以利于构建和鉴定基因组文库。②T-DNA的(为农杆菌介导的植物转化所需的元件)左右边界序列。③F因子复制子oriS和Ri质粒复制子oriR，它们使BIBAC2在大肠杆菌和农杆菌中以1个或2个拷贝形式稳定存在。另外，还有一个交配转移子oriT，在辅助质粒的帮助下，oriT可以启动任何与之共价连接的DNA片段的交配转移。这样BIBAC2既可以通过电击转化，又可以通过三亲交配进行转化。④BIBAC2将多克隆位点和重组选择标记基因sacB置于LB和RB之间，将用于鉴定转化的标记—新潮霉素磷酸转移酶Ⅱ基因(NPTⅡ)和β-半乳糖苷酶基因(GUS)的嵌合体NRTⅡ , Gru，与LB相邻，利用5％蔗糖和卡那霉素就可以筛选重组子和转化阳性个体。

BIBAC人工载体能够轻易插入超过100kb的大片段，以BIBAC载体构建的大片段基因组文库与利用YAC载体构建的基因组文库相比具有多个优点：没有嵌合现象、稳定性好、易于分离插入的DNA、操作简单、可采用高效的电转化体系等。除了上述人工染色体以外，TAC作为一种新型大片段插入载体也得到应用(表8-1)。

不同的载体具有不同的特性和用途，其携带外源片段的能力和宿主细胞的类型也不同，归纳如表8-1。

表8-1不同类型载体的克隆外源片段能力比较

(五)大片段人工染色体载体在基因克隆及基因组中的运用

利用人工染色体载体构建的高质量的大片段基因组文库极大地方便了基因组的研究工作。在大片段基因组文库基础上，目前开展了大规模的物理作图与测序、图位克隆基因及基因转化、分子标记的发掘、着丝粒的研究、基因的定位及比较基因组的研究工作。

(1)大规模的物理作图与测序。YAC, BAC, TAC等文库的建立极大地方便了基因组物理图谱的构建，从而为大规模的测序打下了坚实的基础。分别于2000年6月和2000年12月完成的人类基因组及拟南芥基因组的测序工作就是借助大片段基因组文库完成的。这项工作首先是建立大片段基因组文库，借助指纹图谱及物理图谱和末端测序锚定克隆构建重叠群，之后将大片段克隆覆盖整条染色体乃至整个基因组。

(2)图位克隆基因。用该方法克隆基因无需知道基因产物等信息，只需知道该基因在染色体上的位置。图位克隆有两个关键环节：一是与目标基因紧密连锁的分子标记；二是大插入片段基因组文库(YAC, BAC, TAC等)。迄今为止科学家用这种方法已经在拟南芥、番茄、水稻等生物中成功克隆出多个基因。

(3)着丝粒的研究。着丝粒在细胞分裂中对染色体的行为有重大影响，是染色体的重要骨架结构之一，因此进行着丝粒研究的意义是显而易见的。Miller等利用BAC文库分离出来自于高粱着丝粒的823bp (pSau3A10)的重复序列。所有的这些关于着丝粒区的研究将极大地促进我们对着丝粒的了解，为进一步地研究染色体及基因组分化奠定了基础。

(4) BAC-FISH对重要基因进行定位。在植物中，现有的原位杂交技术主要用于对重复序列、多拷贝基因家族作图。重要基因一般为低拷贝或单拷贝，传统的原位杂交技术难以检出杂交信号，含有目的基因的BAC克隆则因其片段大而与FISH技术结合使信号的检出率大为提高。特别值得一提的是，BAC与DNA纤维原位杂交技术的结合，对重叠群的构建及目的基因的染色体作图将起到非常大的作用。

(5)利用BAC-FISH对近缘种进行比较物理定位和作图。由于几种主要禾本科植物的BAC文库已经基本建立，利用BAC克隆研究这些物种之间基因组的同线性将进一步推进对基因组的比较作图等领域的研究。