根据基因的表达产物可以把基因分为以下几种类型：①不转录也不翻译的基因，如广义上的调控序列；②可以转录但不翻译的基因，如tRNA, rRNA, microRNA等；③既可以转录又可以翻译的基因，如编码各种功能蛋白质的基因(如编码棉花乙醇脱氢酶的基因GbADH)。要清楚地了解植物是如何适应外界环境、抵抗病虫害危害、进行生长发育有必要开展基因的功能研究。开展基因功能研究最直接的途径是：首先能够分离克隆有关的基因编码序列，然后对其功能或者调节网络进行分析，以期达到最终阐明其在植物生长过程中所扮演角色的目的。

简单地讲，植物基因克隆就是通过一定的分子生物学手段(如RACE, cDNA文库杂交等)，将植物基因组中编码基因的DNA分子或者。DNA分离出来，在此基础上进一步对其基因的结构与表达、编码蛋白质定位以及生理生化功能等诸多方面进行研究，从而获得有关该基因的全面信息。

从整个基因克隆的过程和定义我们可以看出，基因克隆涉及核酸分子的切割、连接、扩增和转移等几个过程。这些基因工程操作过程往往要求以不同功能的酶类和载体为基础进行操作。其中，酶类包括核酸分子的切割酶类、连接酶类、扩增酶类以及核苷酸的保护酶类等；载体包括质粒、噬菌体和人工染色体载体等类型。

由于基因工程的有关酶类在生物化学等课程中多有介绍，本章着重对基因克隆所涉及的载体进行阐述。

一、基因工程载体的种类

基因工程载体作为携带外源基因进行复制、表达的元件，通常具有以下结构特征。

(1)具有外源基因重组插入的多克隆位点。

(2)具有能够在宿主细胞中进行复制的有关元件。

(3)载体通常具有可用于阳性克隆鉴定或者重组子筛选所需要的选择标记。

(4)载体通常对受体细胞不具有毒性，同时对环境不存在显著的影响。

现有的基因工程所使用的载体是根据野生型的质粒、病毒DNA或者染色体DNA改造后形成的。这些载体除了具有上述载体的普遍特征之外，依据不同的研究目的载体通常还会增加一些其他的元件，如表达载体具有启动子和翻译的相关元件等。

基因工程所涉及的载体按照所改造骨架的来源可以分为质粒载体、噬菌体载体(包括以噬菌体和质粒为基础构建的Cosmid载体)、人工染色体载体(YAC, BAC, PAC和TAC)等。按照应用对象的不同又可以分为原核生物基因克隆载体、植物基因克隆载体和动物克隆载体等，按照表达的方式可以分为正向表达载体和反向表达载体。很显然，载体的发展和新载体的出现是根据基因工程研究和发展的需要逐步构建形成的。

二、质粒载体

质粒是存在于宿主细胞染色体之外的一种裸露的双链DNA分子(或者RNA分子)。一个质粒就是一个完全的DNA分子或者RNA分子。目前，细菌、藻类、酵母及植物的线粒体中都发现有质粒DNA分子的存在。这些不同的质粒大小各不相同，分子质量的大小从几kb到100kb，但是大多数质粒的大小在10kb以下。

质粒DNA分子通常以共价闭合环状的超螺旋形式存在于宿主细胞体内，少数质粒DNA分子以开环或者线性形式存在。例如，眼虫、衣藻等的线形质粒DNA，疏螺旋体(Borrelia)和链霉菌(Streptomyces)中的双链线状质粒，它们在分子结构上具有末端发夹环、末端反向重复序列以及附着的蛋白质等；在细菌和黏粒中还发现有一类5‘末端附着RNA的多拷贝的单链DNA质粒；在酵母中存在的一种特殊的RNA质粒分子，如酵母的杀伤质粒(killer plasmid)。

在基因工程中，通常使用的已经商业化的质粒DNA大小为5kb左右。这些商业化的质粒DNA分子已经具备了多种不同的生物学特性。这些生物学特性是根据质粒自身的特性和基因工程操作的需要发展形成的。

(一)质粒载体的一般生物学特性

1．质粒的DNA复制

质粒是在宿主细胞中能够自我复制的遗传单元。它是存在于宿主染色体以外的非必要组成部分。质粒能够随着细胞的自我复制而分配到后代中。在宿主细胞内，按照质粒DNA所复制的拷贝数把质粒分为严谨型和松弛型两大类型。严谨型质粒的拷贝数通常在每个细胞10个以下，而松弛型质粒的拷贝数在每个细胞10个以上。质粒的复制过程受基因的严格调控，不像病毒一样在宿主细胞内无限制地复制，从而导致宿主细胞死亡。

对于大肠杆菌的质粒而言，质粒的复制与质粒本身的基因有关，还与宿主细胞染色体上基因有关。在质粒复制过程中，cop基因指令宿主细胞合成阻遏物。当质粒复制到一定的拷贝数时，同时合成的阻遏物的量也不断累积，当这种累积到一定程度时，细胞中的质粒复制就会停止。事实上，质粒复制过程远比这要复杂得多。

质粒的复制与宿主细胞类型、外界条件、质粒大小等因素有关。例如，R1质粒在大肠杆菌中的复制是属于严谨型，而在变形杆菌中的复制属于松弛型。含松弛型质粒的细菌在含有氯霉素的培养基上培养时，质粒的拷贝数大量增加。例如，含COIE质粒的大肠杆菌在氯霉素处理的情况下拷贝数可以达到每个细胞3000个以上，DNA的含量达到细胞总DNA含量的50％以上。对于F质粒而言，其复制过程有多种情况：在37℃条件下，F质粒进行自主复制，而当大肠杆菌转入到42℃时F质粒的复制停止。当F质粒整合到宿主染色体上时，它的复制受控于细菌染色体。

2．质粒的DNA不亲和性

质粒由于类型不同其亲和性有所差异。不同类型的质粒可以在同一个宿主细胞中共存，也可能不能够在同一个宿主细胞中共存。能够在同一个宿主细胞中共同存在的不同质粒称为亲和性质粒，不能够在同一个宿主细胞中共同存在的质粒称为不亲和性质粒。

质粒的这种不相容的特性要求在构建质粒载体时，在同一个宿主的细胞中不应该含有两种不亲和的质粒类型。最好的情况是，在宿主细胞接受外来质粒时不应该有内源质粒。例如，在将pBR322质粒转化到DH5α的大肠杆菌细胞中时，DH5α的大肠杆菌细胞不含内源质粒，便于对外来质粒进行分析检测。

3．质粒的DNA接合性

除了不亲和以及自我复制特性，质粒的另外一个特性是能够进行接合转移。已经证实的具有接合转移特性的质粒包括F, Ti, ColV2和IncP等类型。质粒的接合和迁移作用与两类基因有关。一类基因是mob基囚和bom位点。当宿主细胞内同时存在mob基因和bom位点时，mob基因产物能够识别oriT位点，在结合质粒的TRA蛋白的协助下，使非接合质粒被动地迁移到受体细胞中去。

另一类基因是含有tra基因的质粒，这种质粒能够指令宿主细胞(如大肠杆菌)产生菌毛，合成表面活性物质，促使宿主细胞与受体细胞结合，从而使遗传物质从宿主细胞向受体细胞转移。含有tra基因的质粒通常称为接合型质粒。接合型质粒通常分子质量比较大，拷贝数比较少；而非接合型质粒通常分子质量比较小，拷贝数比较多。在基因克隆过程中通常使用的是非接合型质粒载体，这种质粒比较安全。

(二)质粒载体的构建

质粒载休是最为简单的一种载体类型。用于基因克隆的质粒载体最好具有操作方便、易于检测、插入以后能够稳定不丢失的优点。根据这个要求，质粒载体的构建有以下几个基本原则。

(1)质粒载体具有能够自我复制的元件。通常质粒载体上必须具有可识别的复制起点ori。同时，质粒复制最好是松弛型的，松弛复制的质粒能够保证质粒在宿主细胞中具有较高的拷贝，并能非常方便地提取载体质粒DNA分子。

(2)质粒载体上具有允许外源基因插入的多克隆位点。通常在质粒上具有多个多克隆位点。克隆位点可以是限制性内切核酸酶的位点，如EcoR Ⅰ, BamHⅠ位点等；也可以是具有TA的接头，如pGEM-T系列的克隆载体；甚至可以是重组酶的识别位点，如GATE-WAY系统的质粒载体。

(3)质粒载体上具有可供筛选的抗生素标记。已经在质粒载体上使用的抗生素标记基因包括Ampr, Terr, Kanr等，以及可能根据克降子蓝白斑选择的lacZ基因。

(4)构建的质粒载体应该足够小。由于质粒载体在进行遗传转化时，转化效率与载体大小有关。长片段载体的转化效率通常比较低，而小质粒载体的转化效率比较高，所以已经商品化的质粒载体的片段长度一般为3～5kb。

选择合适的调控元件和出发质粒是成功构建质粒载体的关键，大多数原始出发质粒为pBR322等。从出发质粒中获得复制起始位点、选择标记基因、启动子、终止子等，为质粒载体的构建提供一些基本序列和基础。

根据上述要求，目前构建的质粒载体有上百种，包括现在广泛使用的pUC18/19(图8-1) , pGEM-T等质粒载体。

图8-1PUC18/19质粒载体示意图

MCS表示多克隆位点，Ap表示氨苄抗性，rep表示复制位点