三、单组分的定量方法

根据比耳定律，物质在一定波长处的吸光度与浓度之间成线性关系。因此，只要选择适宜的波长处测定溶液的吸光度，就可求出其浓度。通常应选被测物质吸收光谱中的吸收峰处，以提高灵敏度并减少测定误差。被测物如有几个吸收峰，可选不易有其它物质干扰的、较高的吸收峰。一般不选光谱中靠短波长末端的吸收峰。例如维生素B12的吸收光谱中有278、361、550hm三个吸收峰，其百分吸光系数分别为119、207、63，定量时选用波长毫无疑问为361rim。但维生素B2也有三个吸收峰，267、375、444nm．百分吸收系数大小次序为267nm处最大，其次为444nm处。但267nm处

峰比较窄，444nm峰较宽，容易测准，所以宁可选444nm为测定波长，损失一些灵敏度，而确保测定的准确性。测定时，应以配制样品溶液的同批溶剂为空白对照，采用lcm的吸收池，在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸光度，现代仪器可以直接扫描给出一定波长范围的吸光度，用以核对样品的吸收峰波长位置是否正确，吸收峰波长应在规定波长±l以内，否则应考虑该试样的同一性，纯度以及仪器波长的准确度，并以吸光度最大的波长作为测定波长。吸光度读数，一般在0．2一0．8之间的误差较小。

1．吸收系数法

吸收系数是物质的常数，只要测定条件(溶液浓度与酸度，单色光纯度等)不引起对比耳定律的偏离，即可根据测得的吸光度求浓度。

C=A/EL

常用于定量的是百分吸收系数E，用吸收系数E值作为换算浓度的因数进行定量的方法，不是任何情况下都适用的。特别是在单色光不纯的情况下，测得的吸光度值可以随所用仪器不同而在一个相当大的幅度内变化不定，若用吸收系数换算成浓度，则将产生很大误差。但若是认定一台器，固定其工作状态和测定条件，则浓度与吸光度之间的关系在很多情况下仍然可以是直线关系或近似于直线的关系。

此时，K值已不再是物质的常数，不能用作定性依据。K值只是个别具体条件下的比例常数，不能互相通用。测定时，将一系列浓度不同的标准溶液在同一条件下测定吸光度，考查在何种条件下，浓度与吸光度成直线关系的范围，然后以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制A～c曲线，称为标准曲线，或叫工作曲线。也可用直线回归的方法，求出回归直线方程，再据样品溶液所测得的吸光度从标准曲线或按式来计算浓度。在固定仪器和方法的条件下，标准曲线或回归方程可多次使用。

标准曲线法由于对仪器的要求不高，不但是分光光度法中简便易行的方法，尤其适用于比色分析。

3．对照法

对照法又称比较法。在相同条件下配制样品溶液和标准品溶液，在所选波长处同时测定吸光度。

然后根据样品的称量及稀释情况计算得样品的百分含量。为了减少误差，比较法配制标准液的浓度一般要求与样品液浓度相接近。

例3双氢青蒿素的含量测定取本品约l0mg，精密称定，置50ral量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀后，静置2小时，作为供试品溶液；另取双氢青蒿素对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀后，静置2小时，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液和供试品溶液各lmI，分别置10ml量瓶中，各精密加乙醇1础，摇匀，加2％氢氧化钠溶液至刻度，摇匀，置60℃恒温水浴中反应30分钟，取出冷至室温，以20％氢氧化钠溶液一乙醇(4：1)为空白，照紫外一可见分光光度法(《中国药典》2005年版二部附录ⅣA)，在238nm的波长处分别测定吸光度，计算，即得。

定量分析一般不选光谱中短波长末端的吸收峰。中国药典在制剂的含量测定中大量地应用了紫外分光光度法，在一些原料药的杂质检查中也应用了紫外分光光度法，例如肾上腺素中酮体的检查，对乙酰氨基酚及制剂的含量测定方法为吸收系数法，尼尔雌醇片的含量测定方法则采用对照法。

例4对乙酰氨基酚及制剂的含量取对乙酰氨基酚40mg(制剂取相当于对乙酰氨基酚40mg的量)，用0．4％氢氧化钠溶液溶解并定量稀释成每lml中含对乙酰氨基酚8μg的溶液(制剂需过滤)，在257z，m的波长处测定吸光度，按C8H9NO2的吸收系数为715计算，即得。

例5尼尔雌醇片的含量测定取尼尔雌醇片的细粉适量(约相当于尼尔雌醇10mg)，加无水乙醇溶解并定容至100ml，滤过，取续滤液在280nm的波长处测定吸光度；另取尼尔雌醇对照品，同法操作，计算，即得。

紫外一可见分光光度法作为含量测定方法，由于操作简单，仪器使用方便，价格也比较适中，所以在药物分析中应用比较广泛，但是在选择分光光度法作为某药物的含量测定方法时，要注意到该药物中杂质有元或共有成分的干扰。如在某测定波长，药物有很强的吸收，所含杂质在此波长处无吸收或吸收很弱，这样用紫外一可见分光光度法的测定结果会比较准确，但有些药物中所含的杂质也具有较强的吸收，或共有成分也在所测波长处有吸收，此时就要考虑此方法的可行性了。

四、多组分测定

可利用分光光度法测定样品中两种或多种组分的叠量，由于不需复杂的分离，所以方法比较简便。利用分光光度法进行多组分测定，要求被测组分彼此不发生反应；同时每个组分须在某一波长范围内符合比耳定律。如果符合上述条件，那么在任一波长，溶液的总吸光度等于各组分吸光度之和，即符合吸光度的加和性原则。以溶液中同时存在两组分a和b进行讨论，根据其吸收峰的互相干扰程度，可分为下述三种情况。

对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含O．一4mg的溶液，精密量取此溶液1．0ml、2．0ml、3．0ral、4．0ml、5．0ml，分别置l00ml量瓶中，各加0．1mol／L氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，以0．1moL／L氢氧化钠溶液为空白，在200～250nrn的波长区绘制一阶导数光谱，量取峰零振幅D值，求得D值与浓度c的同归方程。然后精密量取供试品溶液5．Oml置lOml量瓶中，加O．1mob／L氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，照标准曲线项下的方法测定，量取振幅值，从标准曲线的回归方程计算。

例7双波长法测定复方磺胺甲嘿唑片中磺胺甲嘿唑和甲氧苄啶的含量测定

磺胺甲嘿唑：精密称取样品细粉适量(约相当于磺胺甲嚼唑50rng与甲氧苄啶L0mg)，用乙醇溶解并稀释至l00ml，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另精密称取在105℃干燥至恒重的磺胺甲嚼唑对照品50mg和甲氧苄啶对照品l0mg，分别用乙醇溶解并稀释至l00rnl，作为对照品溶液(1)和对照品溶液(2)。精密量取供试品溶液和对照品溶液(1)、(2)各2ml，分别加O4％氢氧化钠溶液稀释至100ml，取对照品溶液(2)的稀释液，以257nm为测定波长(A：)，在304nm波长附近(每间隔0．5nm)选择等吸收点波长为参比波长(A．)，要波长处分别测定供试品溶液和对照品溶液(1)的稀释液的吸收度，求出各自的吸收度差值(△A)，计算。

甲氧苄啶：精密量取供试品溶液和对照品溶液(1)、(2)各5ml，分别加盐酸一氯化钾溶液稀释至lOOml，取对照品溶液(1)的稀释液，以239．Onto为测定波长(Az)，在295nm波长附近(每间隔O．2ntn)选择等吸收点波长为参比波长吸收度，求出各自的吸收度差值(△A)，计算。测定时需注意仪器参数的设定，规定仪器狭缝不得大于1nm。

中国药典附录ⅦJ为维生素A测定法，由于维生素A制剂中含有稀释用油和维生素A原料药中混有其他杂质，所测得的吸收度不是维生素A独有的吸收，非维生素A物质的无关吸收所引起的误差采用校正公式校正，以便得到正确结果。校正公式系采用三点法，除其中一点是在吸收峰波长处测得外，其他两点分别在吸收峰两侧的波长处测定，因此仪器波长若不够准确时，即会有较大误差，故在测定前，应校正仪器波长。维生素A测定法有两种，合成维生素A和天然鱼肝油中的维生素A是酯式维生素A，如供试品中干扰测定的杂质较少，能符合第一法测定的规定时，可直接用溶剂溶解供试品后测定；否则应按第二法，经皂化提取，除去干扰后测定。具体测定方法及计算公式参见中国药典品种项下的描述。

例8托吡卡胺滴眼液的含量测定精密量取本品适量(约相当于托吡卡胺25mg)．置I00ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取l0ml两份，各置l00ml量瓶中，分别加0．1moL／L硫酸溶液与硼砂标准缓冲液并稀释至刻度，摇匀，酸溶液在254nm的波长处测定吸收度(A。。)，缓冲溶液在296nm的波长处测定吸收度(A一)，计算托毗卡胺在254nm波长处的吸收度(A254一0．764A。)，按c。，H。N：0：的吸收系数E：羔为172计算，即得。

五、光电比色法

测定能吸收可见光的有色溶液的方法，称为可见分光光度法，通常又称为光电比色法。光电比色法还可使许多不吸收可见光的无色物，用显色反应变成有色物，用光电比色法测定。通过显色反应，还能提高测定的灵敏度和选择性。

1．显色反应的要求

显色反应有各种类型，如络合反应，氧化还原反应，缩合反应等。其中应用最广的是络合反应。同一物质常可与多种显色剂反应，生成不同的有色物质。究竟选用何种显色剂较好，应考虑下列因素：

(1)灵敏度高光电比色法一般用于微量组分的测定，因此选择灵敏的显色反应是首先要考虑的。吸光物质的摩尔吸收系数的大小是灵敏度大小的主要标志，一般来说，s≥10。时，可以认为该反应的灵敏度较高。

(2)选择性好选择性好是指显色剂只能与某一个或极少数组分发生显色反应。如果仅与某一个组分发生反应的试剂称为特效显色剂，实际上这种特效显色剂是没有的。但是干扰较少或严格控制反应的条件可以除去干扰显色反应的影响，使显色剂成为选择性试剂。

(3)显色剂在测定波长无明显吸收，这样，试剂空白小，可以提高测定的准确度。

(4)有色化合物的稳定性显色反应产物必须有足够的稳定性，以保证测得的吸光度有一定的重现性。

(5)被测物质与生成的有色物质之间，必须有确定的定量关系，才能确保测定的准确度。

2．显色反应的条件

很多显色反应需要创造条件或控制在最佳条件下，提高反应的灵敏度、选择性和稳定性，才能满足光度法测定的要求。因此，必须了解影响显色反应的平衡及反应速度等各种因素，然后利用其有利因素，改善条件，以便得到准确可靠的结果。影响显色反应的因素主要有显色剂用量、pH、反应温度和反应时问。

(1)显色剂用量为了使显色反应进行完全，保证被测组分定量地转变为有色化合物，根据反应的平衡原理，应该有过量的显色剂。但显色剂用量并不是愈多愈好，有时往往加入过多的显色剂，反而生成逐级的络合物，从而影响测定。显色剂的最佳用量一般都是通过试验确定。其方法是将待测组分的浓度及其他条件固定，然后加入不同量的显色剂，测定其吸光度，绘制吸光度A一显色剂浓度c曲线。曲线说明，当显色剂浓度在0～a范围内，显色剂用量不足，待测物没有完全转变成有色化合物，吸光度随c增大而增大。在a~h范嗣内，曲线平坦，吸光度即不随试剂用量而变，对试剂浓度的控制要求不高。这种情况，显色剂用量选择a~b范围为适宜范嗣。