1．电喷雾电离接口的结构与工作原理

配套的电喷雾电离（ESl）接口主要由两个功能部分组成：接口本身以及由气体加热、真空度指示、附加机械泵开关组成的控制单元。在较新的设计中，接口操作包含在系统的整体控制之内。ESI接口的结构如图12-10所示。

图12-10HP1100LC-MSD ESI接口示意图

1-探头；2-取样锥孔；3-隔离阀；4-可清洗挡板；5-萃取锥孔；6-透镜

ESI接口由大气压离子化室和离子聚集透镜组件两部分组成。喷口是由双层同心管构成，外层通入氮气用作喷雾气体，内层用于输送流动相及样品溶液。某些接口还增加了“套气”(sheath gas）设计，其主要作用为改善喷雾条件以提高离子化效率。例如，采用六氟化硫为套气，使用水溶液在做负离子测定时可以有效地减少喷口放电。

离子化室和聚焦单元之间通过一根内径为0.5mm的带惰性金属（金或铂）包头的金属毛细管或玻璃毛细管连接。其主要作用如下：①在离子化室和聚焦单元之间形成真空差，使聚焦单元相对离子化室保持较高的负压；②将离子传输至聚焦单元并将这些离子与加在毛细管入口处的高电压相互隔离；③根据不同离子化模式的需要，还可以通过化学工作站方便地调节毛细管入口处的高电压，此外离子聚焦部分（包括两个锥形分离器和静电透镜）也可以施加不同的调谐电压。
目前，比较先进的接口大都取代了锥形分离器和静电透镜组件而选用六极杆或者八极杆作为离子导向器（ion guide)。六极杆或八极杆被供给大约5MHz的射频电压以有效地提高离子传输效率（>90％)，使灵敏度有了较大幅度的提高。

ESI接口一般都会设计2～3个由附加油泵抽真空形成的不同真空室。其中一个真空室的真空度为2～3Torr，另一个真空室的真空度为0.1～0.2Torr。这两个真空室与喷雾室的常压和离子源的真空（前级，10^-4 Pa；后级，10^-6 Pa）形成一定的真空梯度，从而有效地保证了离子传输效率。此外接口中还有两路不同的氮气，其中一路是不加热的喷雾气，另一路是被加热的干燥气（气帘或浴气），其作用如下：①分散液滴，加快溶剂的蒸发速率；②形成的气帘可以有效地阻止中性分子的干扰，提高被分析样品离子与溶剂分离的效率；③有效地防止因溶剂蒸发以及气溶胶扩散过快造成的分子-离子聚合现象的发生。

样品分子离子化过程可简单描述如下：当流动相携带样品溶液进入喷口后，样品溶液在喷雾作用下被分离成许多直径为1～3um的小液滴。此外在高电压作用下，这些细小液滴的表面电荷分布极不均匀，会进一步分离成更多更小的液滴。另外，在热的干燥氮气的作用下，小液滴的溶剂不断蒸发，体积不断变小，单位表面积的电荷密度也越来越大。当电荷之间的斥力大于表面张力时，这些小液滴会急速爆裂形成更加细小的带电子液滴。子液滴继续重复以上过程直至在其表面形成足够强的电场而将带电离子输入到气相中口样品分子的离子化过程至此结束（本节的稍后部分对离子化机制有较详细的讨论）。

在高电场以及真空梯度的作用下，气相中的带电离子进入玻璃毛细管，经过聚焦单元聚焦最终被送入离子源进行质谱分析。

在没有干燥气体设置的接口中，以上离子化过程也可进行，但流量必须限制在数uL/min，以保证足够的离子化效率。如接口具备干燥气体设置，则此流量可大到数百uL/min乃至1000uL/min以上，这样的流量可满足常规液相色谱柱良好分离的要求，实现与质谱的在线联机操作。

2.碰撞诱导离解功能

毛细管出口与第一级分离器之间的真空区的气压取决于机械泵的抽速及处在常压下的离子化室进入毛细管的气体流量。在该区域内的气压可达数百帕且非常稳定，这为分子离子在该区域内继续碰撞离解创造了条件。此外，还可以通过控制毛细管出口和锥形分离器之间的电压来改变碰撞能量的大小，进而得到丰富的碎片结构信息。碰撞诱导离解（CID）电压通常设置为50～400 V，这样的电压设置对大多数化合物可以产生丰度较高的碎片。

3．多电荷离子的产生与大分子相对分子质量计算

生物大分子（如蛋白质、聚合物）的相对分子质量测定一直是质谱测定中的一个难题，原因是质谱的质量范围有限（约2000u)。同时，易碎、不挥发的大分子也很难转变为气相中的离子并由GC-MS加以测定。近二十年的研究已经开发出了若干接口技术，可用于测定生物大分子的相对分子质量，ESI即为其中的一种。

电喷雾过程中，诸如多肽和蛋白质类的大分子可获得高达数百个质子加成（正电荷）而形成稳定多重电荷离子（multiple-charged ion)，这样就使得单电荷质量范围为1000～2000u的质谱仪可以测定高达几十万的相对分子质量。电喷雾质谱对蛋白质的质量测定范围取决于蛋白质表面可能进行加成质子的位点（碱性氨基酸残基），位点越多，质量测定范围越大。多重电荷离子峰在质谱图上表现为接近高斯分布的一组峰，用这些峰的电荷数及质荷比（m/z）作联立方程求解，可以较准确地计算出生物大分子的相对分子质量。

LC-MS仪器的工作站中一般都有一个被称为三维反卷积（3-dimension de-convolution)的计算程序，其典型计算方法包括如下几个公式。

1)令m₁=(M+n_l-x)/n₁,m₂=(M+n₂-x)/n₂，式中，m为离子的质荷比，m_l＜m₂;n为离子电荷数，n₁>n₂；x为离子化过程中的加成质量（如加氢时x=1.008);M为化合物的相对分子质量。

2）计算离子的电荷数：n₂=(m_l-x)/(m₂-ml),n₁=n₂+1。

3)计算化合物的相对分子质量：M=n₂(m₂-x)。

计算实例（低分辨率测定）：测定两个多电荷离子的质荷比为m_l=694.0,m₂＝867.3，x=1.008则

M=n₁（694.0～1.008)＝692.992n₁

M＝n₂（867.3～1.008)＝866.292n₂

所以，

692.992n₁＝866.292n₂

因为，

n₁＝n₂+1

所以，

692.992(n₂+1）＝866.292n₂

所以有，

692.992=173.3n₂

n₂＝4，n₁＝n₂+1＝5

M＝692.992n₁＝3464.96

M＝866.292n₂＝3465.17

4. ESI的离子化机制

自Aleksandrov等的早期工作把电喷雾过程描述为“大气压环境下从溶液中萃取离子”以来，研究者常把电喷雾电离归诸于去除溶剂的机理，这与FAB,SIMS,MALDI等“解吸方法”形成鲜明的对比。尽管ESI是从溶剂中移出离子，但大量的证据表明从ESI质谱图观察到的离子与液相中存在的离子是不一样的。Fenn建议把不同的离子产生过程分类为“场解”技术和“能量突爆”技术。

离子源的高真空区域。这个接口通常被称为大气压电离（API）接口。虽然可以设计各种各样的接口，但API接口还是有几个共同之处。API接口的硬件可大致分为两部分：大气压区和真空接口，EST和APCI在大气压区域的组件各自独立但可以互换。

电喷雾电离的过程如下：在毛细管末端高电压的作用下，管内的极性溶剂产生气溶胶喷雾（通常情况下为提高雾化效率还附以雾化气或超声雾化气装置），然后通过取样小孔或者气液分离器将液滴输送至真空系统。另外，为了减少由于液体膨胀吸热产生的簇离子，可以同时使用加热区溶剂的方法以干燥浴气。在离子传输过程中，真空接口的差级真空系统和离子聚焦系统有效地保证了离子传输效率。而真空系统的碰撞诱导离解（CID）不仅可以克服溶剂簇离子，还可以提供丰富的碎片结构信息。

电喷雾过程本质上也是电泳过程，即利用高压电场将溶液中的正负离子分离的过程（图12-11)。例如，在正离子扫描模式下，电喷雾电离针相对真空取样小孔具有很高的正电位，带负电荷的离子被吸引到放电针的另一端，并且会形成表面聚集着大量正电荷的半月形液体。由于同种电荷相互排斥，当静电力场与液体表面张力达到平衡时，液体表面锥体的半顶角为49.3^o,G.Taylor将其称为“Taylor锥体”。由于小液滴的体积不断变小，电荷密度越来越高，最终导致过剩的正电荷克服表面张力从Taylor锥体的尖端溅射出来。

图12-11 ESI内的电荷分离以及小液滴分裂过程

从表面上看，强极性的溶剂（如水等）因具有很强的导电性而更适合产生电喷雾。但是水的表面张力非常大，要使纯水产生电喷雾必须提供足够高的喷雾电压。与此同时还可能会产生其他一些棘手的问题，如当采用负离子扫描模式时，在高负喷雾电压的作用下会导致其发射电子。APCI的电离机理虽然是电晕放电，但是EST源内的放电会阻碍离子生成，严重时可能会损坏离子源的内部元件。在这种情况下，使用具有俘获电子功能的氧气流或SF₆流（统称为鞘气流），可有效地解决负离子扫描模式下的放电现象。

D.P.H.Smith提出的公式可以解释影响电喷雾过程的几个参数。影响电喷

雾电压V_on (kV)的主要因素包括电喷雾针的半径r(um)、溶剂的表面张力γ(N/m)以及喷雾针尖和反相电极之间的距离d(mm):

若使用甲醇作溶剂(γ=0.0226N/m),喷雾毛细管半径为50um,喷雾针尖与反相电极之间的距离为5mm，则可能发生电喷雾的电压为1.27kV，如果换成水，则发生电喷雾的电压就要上升到2.29kV。

解决电晕放电的另一种途径是减小喷雾针的直径。在纯水实验中，将喷雾针的直径由50um减到10um,喷雾电压就可从2.29kV降至1.3kV。

有趣的是喷雾电压并不需要直接施加在喷雾针上，在JEOL公司的设计中，高电压并不是直接加在喷雾针上，而是加到了带有雾化气装置的金属套管上。Ana-lytics of Branford公司设计使用带有金属端头的玻璃毛细管，允许喷雾针的电压接地，而在毛细管接口的入口处施加了一个负高压。这样做可以避免电流通过LC或注射泵的导电溶液引发漏电问题，但它并不减小针尖放电的可能性。最近，Wang和Hackett报告了使用圆柱形电容器可以在无电离电压的针尖处产生气溶胶喷雾，从而能够诱导电荷的分离。Hirabayashi及其合作者还证实了使用喷气速率达1马赫（(1马赫＝340m/s）的高流速喷射溶液也可产生带电离子，不需要施加任何电压；摩擦生电也会使它电离。

由喷雾针喷射出的细小液滴本身带有大量的正电荷，溶剂不断挥发，小液滴的体积越来越小，单位体积的电荷密度越来越高，当电荷之间的斥力可以克服溶液的表面张力时，小液滴会喷射出比其本身更加细小的液滴。此时电荷斥力与表面张力相等且服从瑞利（Rayleigh)稳定限：

式中，q_Ry为小液滴电荷数；R为小液滴的半径；ε_o为真空介电常数；γ为表面张力。

带电的小液滴会自发喷射出众多细小液滴以降低自身的库仑力，随着样品溶剂不断蒸发，体积不断减小，喷射出的细小液滴再次达到Rayleigh稳定限，然后在电荷斥力的作用下进一步喷射出更加细微的液滴。因此，Kebarle等把这个过程称为“不均匀裂解”或“小液滴喷射裂解”。

电喷雾电离和大气压化学电离共用一个真空接口，就可以把离子引入到质谱