1．大气压化学电离接口的结构及工作原理

大气压化学电离（APCI）接口的结构如图12-12所示。

图12-12HP110OLC-MSD-APCI接口示意图

1-液相入口；2-雾化喷口；3-APCI蒸发器;4-电晕放电针；5-毛细管；6-CID区；7-锥形分离器；8-八极杆；9-四极杆；10-HED检测器

APCI接口相比ESI接口，区别如下：

1)增加了一根能够发射自由电子的电晕放电针，对共地点的电压设置为±(1200～2000)V，该放电针对离子化过程的启动起着至关重要的作用；

2)采用直接加热喷雾气体的方式，拓宽了干燥气体的可加热范围；

3)流动相的组成对喷雾气体的加热和APCI的离子化过程影响较小，囚此在APCI接口的LC-MS中可以使用水相比例较高的流动相。

APCI接口的工作原理为：电晕放电针释放的电子首先轰击空气中的氧气、氮气以及水蒸气并生成相应的带正电的初级离子，然后初级离子与样品分子发生分子-离子交换使样品分子离子化。

2．进样方式

(1)注入方式

该方式借助注射泵推动钢化玻璃注射器将待测溶液连续注入质谱仪。在这种进样方式下，可在离子化室中生成许多连续稳定的带电荷的离子。因此，注入方式广泛用于仪器调节、蛋白质检测以及高纯物质的测定等领域。在正常情况下注入方式进样所得到的为一大小恒定的信号输出，总离子流色谱（TIC）图表现为一条直线，样品纯度低时，由于无法扣除流动相背景，不能获得纯净的质谱图。

(2)流动注射分析方式

流动注射可用注射器泵串接一个六通阀或以HPLC泵配合进样器来进行。流动注射分析（FIA）可快速地获得样品的质谱信息，在样品预测试中很实用。由于没有柱分离损失，可获得较高的样品利用率。同时由于TIC图中样品峰的显现，可以方便地对流动相含有的本底进行扣除，获得较干净的质谱图。由于没有柱分离，FIA方式对样品的杂质本底仍无法扣除。

(3)与HPLC联机使用方式

联机采用“泵-分离柱-ESI接口”的串接方式，有时也在分离柱的出口处接入一个T形三通，将一端接紫外检测器，或将紫外检测器与质谱串接，可同时获得紫外信号（UV检测器）或紫外光谱（DAD检测器）。当HPLC的流动相组成不适合ESI的离子化条件时，也可在此三通处接入另一台泵，加入某些溶剂或一定量的助剂作柱后补偿或修饰，如在蛋白质分离及质谱检测中广泛使用的“TFA-fix”技术。HPLC-ESI-MS联机要求液相泵的流量很稳定，因此要采用流量脉动较小的HPLC泵系统或采用有效办法消除脉动。

3．流动相化学

理论上，LC-MS分析中流动相的组成可以在100％的水到100％的有机溶剂范围内变化。但在离子化过程中，大量水的存在由于其需较大的气化热而使得脱溶剂困难，从而会大幅度地降低离子化效率，因此实际操作中要尽可能地优先考虑使用较高比例的有机溶剂。

确定流动相的组成及溶解样品所用的溶剂时要考虑如下几个方面的问题：

(1)离子在溶液中的预形成

当被分析物分子是可以明确定义的酸或碱时，可根据所采用的测定模式ESI（+）或ESI（-），在样品溶液和流动相中加入一定比例的（0.1％～0.01％）有机酸或碱，以促使离子在溶液中的预形成。被分析物分子固有的酸碱性和有机溶剂的质子自递作用可用来预测和解释离子的预形成。离子预形成的相应测定模式为：①酸性化合物+有机碱（三乙胺），采用ESI（一）测定；②碱性化合物+有机酸（乙酸）→M⁺，采用ESI(+)测定；③酸性或碱性化合物+两性溶剂（水、甲醇)→M⁺或M^-。

(2)流动相的选择

诸如乙腈、甲醇、水以及乙酸、甲酸及其铵盐缓冲液是最为常用的流动相，原因是它们具有：①显著的质子自递作用，有利于离子在流动相中的预形成；②适中的介电常数，避免喷口放电；③强挥发性，易脱去，不易形成溶剂加成物。乙腈在APCI分析中优先被考虑使用，原因是它有较强的电子交换作用。

(3)难挥发盐组成的缓冲液

难挥发盐组成的缓冲液，如磷酸盐的缓冲液不易在ESI和APCI操作中使用，尤其是在较高浓度下更不能使用。在蛋白质和肽类的液相分离中经常使用的三氟乙酸（离子对试剂）对离子化有严重抑制，要以柱后补偿（通常使用异丙醇）的方法抵消其影响方可获得较高的离子化效率。

(4)分子的加成作用

在选择流动相时也要考虑到某些离子对被分析分子的加成作用，如(M+H)⁺,(M+Na)⁺,(M+NH₄)⁺等。作为(M+H)⁺出现的准分子离子峰是一个质子加成产物，对绝大多数化合物的离子形成都是必要的；(M+Na)⁺峰的出现对某些特定的化合物是很难避免的；(M+NH₄)⁺则是大多数情况下由于人为加入而产生。目前对离子加成的认识尚处在经验阶段。加成离子的产生对有些碎片较少的化合物可以起到增加质谱特征性的作用，但同时也使得一些化合物的质谱数据的使用变得复杂，如蛋白质和肽类的质谱识别和相对分子质量计算。

4. APCI离子化机理

APCI的离子化作用机制有以下三种机理：经典APCI(classical APCI)、离子蒸发（ion evaporation）和摩擦电APCI(triboelectric APCI)。当流动相和待分析物进入喷口时，被喷雾气撕裂成小雾滴，在此过程中会导致气液界面上因摩擦而满电，并使分析物离子化，这种满电不取决于放电针产生的电子，即使在放电电压较低或无放电电压时也可能使样品离子化。

(1)经典APCI机理

首先，高压放电针通过尖端放电释放出大量的电子，这些电子不断轰击空气中的氧气、氮气、水蒸气以及溶剂分子（甲醇等）使其生成相应的带正电的离子，然后这些初级离子与被测样品分子发生分子-离子交换（质子交换和电子交换），最终使样品分子带电。该过程可用如下通式表述：

质子交换：RH⁺+T→TH⁺+R或R^-+TH→T^-+RH

电子交换：R⁺+T→T⁺+R或R^-+T→T^-+R

其中，质子交换以水合质子或质子化的水簇状物按照如下通式进行：

H₃O⁺(H₂O)_n+T→TH⁺(H₂O)_m+(n-m-1）H₂O

在进入质量分析器之前，质子交换过程产生的TH⁺(H₂O)_m、中的水须在辅助器或高真空作用下脱去生成TH⁺。但是甲醇等一些性质稳定的化合物通常在质谱中以如下形式存在：CH₃OH₂+(m/z 33),CH₃OH₂⁺·H₂O(m／z 51),CH₃OH₂⁺·(CH₃OH)_n(m/z 65，97，…）。

经典APCI离子化方式适用于分析检测中等以及小极性的化合物。

(2)离子蒸发机理

离子蒸发机理不仅适用于ESI过程，而且适用于APCI过程。这种机理类似ESI的离子化机制，非常适合分析检测一些可在溶剂中预先电离生成相应离子化合物的强极性分子。

5．联机的流量匹配和参数优化

在ESI质谱分析中流量的选择对色谱分离效果和离子化效率而言常常是相互矛盾的。一般流动相流速越大，离子化效率越低；而一定内径的HPLC柱又要求适当的流速才可保证分离效率。因此流量的选择往往只能是色谱分离效果和ESI离子化效率的兼顾。为获得较好的柱上分离和较高的离子化效率，在实际操作中最好采用1～2mm内径的液相柱，用300～500uL/min的流速进行分离测定。如果不得不在大流量下分离，则可采用柱后分流，但这样会牺牲样品利用率。采用
＜1 mm内径的色谱柱也是流量匹配中的一个选择，随着此类色谱柱价格的降低，它已经变为一个实际可用的办法。

ESI和APCI质谱的调机所用的标准化合物一般为厂商提供的配置在混合溶剂中的小肽类分子，并选定几个在通常操作条件下可产生的、稳定的单电荷离子推荐使用。较新型的几种商品仪器化学站中安装有自动调机程序、早期的为手动调整。调机时首先确定要使用的质量范围，以便在调机时有意识地照顾这个范围（或小或大）。同时，最好根据被分析化合物的预试确定接口和质谱的各项参数的设置，并最好在此条件下再次进行调机。

调机时的参数设置要以得到尽可能高的调机离子的信号（灵敏度）和最窄的峰宽（分辨率）为目标，也要同时兼顾灵敏度和信噪比。

调机中优化的主要参数为聚焦组建的电压设置，即两级锥形分离器和静电透镜上的电压设置以及CID的电压设置。有时也要对接口的各个高压设置进行调整。聚焦组建中的六极杆或八极杆的参数设置一般为不可调。