20世纪40年代末期，出现了飞行时间质谱（time-of-flight mass spectrome-try, TOF MS)技术，但直到90年代这个技术的应用一直没有得到很大的发展。近年来TOF技术的发展包括正交加速（orthogonal acceleration)、离子反射加速器等，显著地改善了TOF质谱的分辨能力；高速模数转换器（analogue-digital con-verter, ADC)数据采集系统可以获得更高的质量精度和更宽的动态范围。经过改进的质谱使用简单，加上为人们所熟悉的EST, APCI等接口技术的结合，使得TOF质谱成为了一种具有高分辨能力的、既可用于小分子又可用于大分子化合物的质谱联用技术。

目前应用于TOF质谱的接口主要为API及APCI。

1. LC-TOF质谱联用仪的构成

质谱样品的导入方式与其他液质联用仪器相同。图12-9为一典型的EST接口和正交加速飞行时间质谱联用的结构示意图。经EST接口离子化的样品进入质谱的第一级真空，离子通过一个锥孔后进入第二级真空，并被第一个八极杆聚焦。八极杆是一套平行安装的金属杆，其上施加的射频电压形成一个射频静电场，可以使一定质量以上的离子进入八极杆开放的中心，同时达到聚焦的目的。通过第一、个八极杆的离子已经进入第三级真空，此时真空度已经很高，致使离子之间的碰撞很少发生。如图12-9所示，通过第一个八极杆的离子立即进入第二个八极杆，此时它们已经处在第四级真空中。第二个八极杆施加频率为5MHz的射频电压并含有直流电压分量用于加速离子。采用5MHz的射频可以保证通过的离子质量范围为m/z100～3000。

图12-9LC-TOF质谱联用仪的结构示意图

1-HPLC入口；2-喷雾器入口；3-喷口；4-分析物离子；5-废液；6-加热氮气；7-毛细管；8-锥；9-真空墙；10-八极杆；11-聚焦透镜；12-狭缝；13-离子镜；14-飞行管；15-离子脉冲发生器；16-信号

在第四级真空下，离子束离开第二个八极杆进入离子束修整光路。修整（sha-ping）功能由一个聚焦透镜和一个直流四极杆来完成，使得离子束在进入飞行时间质谱的分析器之前得到最佳的平行性和尺寸。离子束越平行，分辨能力越好。

在离子被修整为一个平行的离子束后，进入第四级真空和最后一级真空，在此处飞行时间质谱开始。由于每一个离子的质量分布是依其飞行时间来确定的，因此此阶段的背景气体压力必须很低。任何离子与残存背景分子的碰撞将改变离子的飞行时间，并影响它们的质量分布的准确性。

在飞行时间质量分析器中，接近平行的离子束进入离子脉冲发生器。离子脉冲发生器为一叠平板，除背板外，这些平板中心有孔。离子由第一个平板和背板之间的边缘进入这一组平板。背板上施加高电压以启动离子飞行进入检测器，同时也加速离子使其通过脉冲发生器。

离子离开离子脉冲发生器，通过一个长度约为1m的飞行管飞行。飞行管的另一端为一个两段的离子反射镜，它们改变离子的运动方向，使其再回到离子脉冲发生器。两段离子反射镜有两个不同的电场梯度，一个在离子反射镜截面的开始处，另一个在离子反射镜的较深部位。这样一种设计改善了离子在检测器上的时间聚焦。由于离子在进入脉冲发生器时带有一定的水平动量，它们在飞行过程中除垂直飞行外，还将继续以水平方向飞行。这样它们就不会被反射回离子脉冲发生器，而是到达了检测器。

2．飞行时间与质量的关系

(1)飞行时间公式

每一个特定质量的离子有一个特定的飞行时间（飞行时间质谱必须满足的要求）。飞行时间由高电压脉冲施加于离子脉冲发生器的背板时开始，到离子撞击检测器为止。飞行时间取决于离子加速能量E、离子飞行距离d以及离子质量m（或质荷比m/z)。有两个公式可用于飞行时间质谱。其一为动能公式

这个公式说明，在飞行时间质谱过程中较小质量的离子在时间上先到达检测器，而测定时间要远比测定速度容易。

第二个公式是速度、时间和距离的关系式：

v＝d/t

结合第一个公式和第二个公式，得

m＝(2E/d²)t²                          （12-3）

这样就给出了一个基本的飞行时间的关系式。对于一个给定的能量E和距离d，质量正比于离子飞行时间的平方口在正交飞行时间质谱的设计中，许多努力用于保持施加于离子能量的恒定和离子飞行距离的恒定，以便准确地测量飞行时
间并给出准确的质量值。式（12-3)中的E和d为常数，可以写成

m＝At²                          (12-4)

这是一个理想方程，可以确定离子的飞行时间和它的质量之间的关系。由于质量正比于离子飞行时间的平方，如果被观察到的飞行时间加倍，所得的质量数将变为4倍。实际上，从电子控制送出一个起始脉冲到高电压存在于离子脉冲器背板，总会有一个时间延迟。同时由离子到达离子检测器的前部表面到离子被采集电路调制成为数字信号也会发生一定的延迟，尽管延迟非常短，但很重要。因为真实飞行时间无法测量，所以有必要通过减去总的延迟时间t_o，校正被测量的时间t_m，并重新表示为

t＝t_m-t_o

通过这个校正，用于实际测量的公式变为

m=A(t_m-t₀)²                          (12-5)

(2）质量校正

为了将测量到的飞行时间转换为相对应的质量，A和t₀的值必须加以测定并实施校正。可以通过测定一组已知精确质量的化合物溶液用于校正。测定的结果及校正见表12-1。既然m和t₀,对于一定质量范围内的质谱是已知的，计算机将
由此计算并确定A和t_o。此时运用非线性回归确定A和t_o，以便校正公式，对于溶液中的7个给定质量尽可能地匹配。
表12-1TOF的质量校正

虽然这个初始的A和t₀测定是高度精确的，但对于飞行时间质谱的分析仍嫌不足，需要第二个校正步骤。所以在系数A和t₀被测定之后，要将质量的实际值与计算值加以比较，典型的误差为百万分之几。由于这些误差较小并且在一段时间内是稳定的，所以有条件进行第二轮校正，以实现更好的质量精度。这一轮的校正将使用一个公式，在全部质量范围内进行。该校正方程为一个高阶多元方程，作为飞行时间质谱校正的一部分存储于仪器中。如果不考虑其他仪器因素，在这两步校正之后，存留的典型误差值在整个质量范围内为10^-6或更低。

(3)参比质谱校正

精确的质量校正是得到一张精确质谱的第一步。当质量精度误差要求低于3×10^-6时，任何微小的变化施加给离子都会引起可观的质量漂移。因此，可以使用参比质量校正来消除这些影响因素，此时要将一个或一个以上质量已知的化合物由样品仪器导入离子源。仪器软件持续地以已知参比物的质量来校正被测定的未知物的质量。为了导入参比物质，在ESI源中可以增加第二个喷雾装置，第二个喷雾装置与参比物质的传输系统相连接并可由以工作站软件控制。

质谱仪器软件中含有一个可编辑表格，可输入参比物的准确质量。在质量分析器采集的过程中，已知的质量数可以识别，从而使A和t₀值被重新优化。每一张存储的质谱都有自己的A和t₀值，因而最小的仪器变化都可以得到控制，因为每一张质谱都可以根据这些值和校正方程（前述的高阶多元方程）加以校正。

为了测定两个未知数A和t_o，参比物质必须含有至少2个已知质量的成分。

为了很好地得到A和t_o，至少有一个参照物要有较低的质量而另一个要有较高的质量。对于最好的结果，低质量的和高质量的范围之间要包括操作者感兴趣的离子。在LC-TOF MS中，参比质量校正运算需要一个m/z等于或小于330的离子（如m／z＝300)，而另一个离子的m／z至少要比低质量数大500。

(4) TOF的测量循环

TOF的测量不能由施加在脉冲发生器上的一个脉冲所产生的离子来完成，而是许多脉冲产生的离子信号总和。当一个高压施加在离子脉冲发生器上时，产生一张新的（原始）质谱，作为暂态（transient)值被数据采集系统记录下来。这个暂态值累加到先前的暂态值，直到预定的测量数完成。一般质谱分析要求有一定的扫描速度（质谱数目），因此在数据传输到计算机并记录到硬盘时，可以有10 000张质谱被累加。如果仪器配置中使用了高速色谱，被累加的暂态值可以减少一些，以便加快扫描速度。

测定的质量范围限定了脉冲发生器的触发次数和记录到的暂态值数目。一旦脉冲发生器被触发，它要一直等到感兴趣的最后一个离子到达倍增器才进行第二次触发。否则，第二次触发中产生的轻离子将会在第一次触发中的重离子之前到达倍增器，并产生质谱的错误重叠。

表12-2举例表明了几种离子大概的飞行时间和可能的暂态值，它是由2m的飞行距离和6500V的飞行电压计算得到的。在此条件下，m/z 3200的离子大约有l00us的飞行时间(2m)。由于两次暂态值之间基本上没有延迟，m/z 3200的离子会得到10000个暂态值的记录。对于较小的质量范围，脉冲发生器可以在更高的速度下被触发，如表中m/z 800 (m/z 3200的1/4)的离子飞行时间则缩短为50us，因而它可以在m/z 800的质量范围内得到20 000个暂态值的记录。相反，当飞行时间为141us时，m/z为6400的离子只能得到7070个暂态值的记录。

表12-2几种离子的飞行时间和暂态值

(5）质量精度的理论限制和实际限制

无论数据采集系统使用的是TDC（时间转换）或是ADC（模数转换）技术，累加的信号到达时间取决于各个单独的暂态值的（分布）重心。尽管如此，TDC技术设计的核心在于测定每一个离子的到达时间，表现为到达时间必须是暂态值加和的总体平均值。影响暂态值测定精度的一些限制因素如下。

1)离子统计（ion statistics)。第一个理论上的限制由被测定离子的数目和它们的时间分布而产生。如果分布较窄，分布较好，质量分布重心或平均值可以精确地测定，则测定结果偏差可做如下描述：

式中，σ为所得测定结果的标准偏差；R为质谱分辨本领；n为检测到的离子个数。如果希望在95％的置信度下，2σ为3×10^-6，那么在分辨本领为10 000时，所需的离子数目为1000个。在一个以质量重心表达的质谱中，为了增加离子个数，一般是由分析软件在一个色谱流出峰的特定宽度上进行平均化处理。应当注意的是，尽管TOF具有快速扫描的潜力，但由于减少扫描时间会减少暂态值的数量，从而会减少精确质量测定所需的离子数目。扫描速度和质量测定的精确程度仍然是相互矛盾的，所以最精确的测定仍应该在较慢的扫描速度下完成。

2)化学背景。化学背景是影响质量测定精度的另一个重要因素。尽管TOF的高分辨本领有助于减少背景在样品信号上的叠加机会，TOF的质量测定中即使是一个很小的未加分离的杂质都会引起测定质量的漂移。以下这个简单的计算可
以衡量它的影响程度：

式中，△_obs为观察到的漂移，ppm;△_干扰为样品离子和背景干扰离子的质量差；A_干扰和A_样品分别为干扰离子和样品离子的峰高或峰面积；如果TOF的分辨率为10 000，样品离子与干扰离子的质量差为50×10^-6，二者的相对峰高为10:1(样品:干扰），观察到的质量漂移将是50×10^-6/(10+1)，大约是5×10^-6。

同其他质谱技术一样，化学背景物质离子对于精密测定质量的影响也只能通过使用高纯度溶剂、加强仪器的密封性和经常保持仪器的清洁来控制。

(6）动态范围

动态范围（dynamic range）可以用不同的方式来衡量。对质谱学，最为准确的定义在扫描内（in-scan)。这是指在一个单一质谱中的动态范围，可以定义为最大m/z和最小m/z有价值质谱峰的信号丰度比。即便是定义为扫描内动态范围，上下限也必须加以定义。此时，要做理论和实际的考虑。

理论上一个离子的检测是可能的，但实际上化学背景在大多数情况下都会使这一个离子的检测变得模糊不清。实际的限定依赖于实际应用，如当仪器用于精密质量测定时，动态范围的下限将由最小样品量来决定，使用最小样品量进行测定是精密测定必需的。

为确定最小样品量，要考虑离子统计（ion statistics）的限定。假定精度要求为5×10^-6，基于单一未平均化处理质谱的测定置信度为67％，校正误差则为1×10^-6。

那么，1σ=4×10^-6。如果仪器的分辨率本领为10 000，则此时测定必要的离子数口为200个。这个计算方法来自离子统计和分辨本领，与采集技术无关。这种计算首先要假定仪器有足够的灵敏度（信噪比），以便测定不受背景干扰的影响。

为了确认最好的质量测定的精度，采集系统方式也是一个要考虑的问题。对于TDC系统，给定质量离子的每个暂态值的一个离子，理论上讲有限定。对于ADC系统，则依赖于检测器的增益，在单一暂态值中一个给定质量的许多离子可以被精确地测量。LC-TOF MS中自动调谐（auto-tune）软件的目标检测器增益为平均5点的离子响应。在一个暂态值中ADC可以有8比特（bit)或255点，因而高达50个的给定质量离子可以得到测定。

就实际测定而言，TDC和ADC技术精确测定质量的上限都有一定的限制。对于TDC，在每一个暂态值中一个离子被测定的水平远未达到之前，可观的质量漂移就已经出现了。死时间（dead time）校正运算可以补偿这个漂移，但只能在达到理论极限的一定份额时有作用，典型值在0.2～0.5离子／暂态值。无论是TDC或是ADC技术，当测量在色谱峰的上升和下降阶段进行时，都需要考虑安全性缓冲，这是因为色谱峰可能上升到饱和，此时即便采用10 000暂态值的平均值，最终的质量测定也只能达到应有水平的50％。表12-3总结了理论和实践的动态范围限制，这些限制是针对TOF质谱所采用的ADC和TDC技术，针对单一质谱的扫描内的动态范围所总结出的。

表12-3单一质谱扫描内的动态范围