一.液相色谱-质谱联用的方法原理

HPLC-MS是利用液相色谱作为质谱的进样系统，使复杂的化学组分得到分离；利用质谱作为检测器进行定量和定性分析。

1.液相色谱法的基本原理

色谱法作为一种分离分析方法，其最大的特点在于能将一个复杂的混合物分离为各个有关的组成，然后一个个地检测出来。一般色谱过程中不同组分在相对运动、不相混溶的两相间进行交换，相对静止的一相称为固定相，另一相对运动的相称为流动相，利用吸附、分配、离子交换、亲和力或分子大小等性质的微小差别，经过连续多次在两相间的质量交换，使不同组分得到分离。根据填充材料和分离原理的不同，液相色谱法主要可分为吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子色谱四大类。

2．质谱法的基本原理

质谱法的基本原理是通过分析离子化样品的质荷比来实现对被测化合物定性定量分析。当被检测样品进入质谱仪，在质谱仪离子源中，化合物被离子轰击，电离成分子离子和碎片离子，这些离子在质量分析器中，由于质荷比不同，运动轨迹不同，通过电子倍增管检测放大的信号传入显示器，展现出一幅完整的质谱图。一般质谱图的横坐标是质荷比，纵坐标为离子的强度。离子的绝对强度取决于样品量和仪器的灵敏度；离子的相对强度和样品分子结构有关。同一样品，在一定的电离条件下得到的质谱图是相同的，这是质谱图进行有机物定性分析的基础。GC-MS由于是在El方式下电离，任何公司生产的仪器都可以获得很好的质谱图重现，因此其具有了标准的图谱库，以方便科研工作者使用。液质联用仪常用的电离源有大气压化学电离源和电喷雾电离源，得不到可供检索的标准质谱图，不能进行库检索定性，只能提供相对分子质量信息，可通过采用串联质谱仪获得碎片信息，用来推断化合物结构。高分辨质谱仪，可以精确测定分子离子或碎片离子的质量，依靠计算机可以计算出化合物的组成，对化合物的定性很有帮助。

二.液相色谱-离子阱质谱联用技术

1．离子阱的构成和操作

离子阱为一个离子存储装置，主要由一个环形电极和置于电极上下两端的两个端盖（endcap）电极构成（图12-6)。三个电极的内表面呈近似双曲线型。处在端盖电极中心的小孔允许离子进出该阱。一定固有频率的射频电压施加于环（电极）上，电压(0～12 000V）回路接地点为端盖电极(0～20V)，这样就在环电极和端盖电极之间建立了一个高频（电）势差，形成了一个四级场。依靠这个具有不同射频电压（VRf）值的四级场，离子阱可以在一个特定的质量范围内俘获并稳定一定数量的离子。四级场可以看作一个三维的“槽”或是一个伪势阱（离子阱由此而得名）。这个势阱的“深度”与粒子质量、射频电压有关，在仪器实际设计中，势场要能在足够宽的质量范围内对离子产生作用力，这样仪器才可以进行质谱的全扫描并同时兼顾足够的灵敏度。

另一路射频辅助电压被施加在离子阱的出口端盖电极上，这个附加电压在扫描的不同阶段，即前体离子的分离、碎片化和质量分析阶段，可用于不同的目的。

由于LC-离子阱质谱的离子不是产生于阱内而是来自于阱外，这样就需要一个机制来解释为什么它们可以被离子阱产生的伪势阱所俘获。实际上离子阱的设计无需其他手段，被聚焦的外部离子可以容易地通过第一个端盖“滚入”另一个阱内四级场产生的伪势阱中，并且由于能量守恒规定它们要持续“上下滚动”或由另一个端盖逸出离子阱。由于这个原因和其他原因，阱内设计了碰撞气体(He)，碰撞气体（也称为阻尼气体）分子的存在是非常有必要的，因为它可以吸收离子束的能量，并导致一定份额进入阱内的离子驻留。其他影响阱俘获效率的参数有进入阱内的离子束的能量、离子的质量及其m／z、势阱的深度以及Rf在离子注入点上的实际位相。各种离子的俘获率可以不相同，对于m/z 500(单电荷）的离子，当阱内的操作压力为0.1Pa(10-6 bar）时，其俘获率应为5％左右。

图12-6离子阱质谱示意图

由于离子阱是一个（离子）存储装置，因此它可以在一个希望的时间范围内积累信号。如果进入阱内的离子信号较强，累积时间可以短到lms，但在痕量物质的注入实验中，它可以增加到1s。质谱和质谱一质谱测定中，典型的累积时间（accu-mulation time）设置为0.01～200ms。通过变化累积时间，离子阱分析器的动态质量范围可以获得很大的发展。

2．离子阱质谱的产生

如图12-7所示，1～4个分立事件被连接成为一个连续事件时就构成了一个扫描连续过程。这个连续过程的示意图总结了主射频（Rf)电压（primary Rf电压，施加在环电极和两个端盖电极之间）和辅助Rf电压施加的时间协同（图中采样锥孔含有开启和关闭两个动作），表明了振动和清除（displacement)以及质谱的最终产生。

图12-7离子阱质谱产生的过程

离子阱的质谱过程发生时，首先是离子被充入离子阱，这是通过降低施加在采样锥孔上的排斥电压，让离子束通过来实现；进入阱内的离子被施加了低于四级振幅的射频场俘获。经一定设置时间的累积后，采样锥孔的排斥电压升高，以组织后续离子进入阱内。累积的离子被阱内浴气（He)通过碰撞而“冷却”，以确保离子“云”定位（驻留）于阱中心一定的空间范围内。扫描开始后，四级和二级的势场增加，离子按质量增加的顺序通过出口端盖被“逐出”离子阱。扫描结束，四级场将低到零以清除残留在阱内的离子。然后，阱回到初始状态，采样锥孔设置为允许离子进入并累积的开启状态，新的循环（cycle）开始。

3. Mathieu稳定图

描述的离子稳定区域可以用一个简单的方程来表达，即

式中，q的稳定性与射频频率（W）、射频电压（V_Rf)、离子质量（m)、离子电荷（z)及离子阱的曲率半径（r_o）有关。通常仪器操作中r_o为常数，因此由此方程可以看出，稳定性因离子的质量、电荷及所施加的射频频率和电压而变化。

因此有四种途径扩展阱的质量范围，如升高环电极上的Rf电压，降低射频频率W，减小阱的尺寸r_o。

被俘获于阱内的离子会在径向（radial)和轴向（axial）上经历周期性的运动。沿端盖方向的运动是第一位重要的，因为它是离子进入阱内和逸出阱外的方向。产生势阱的四级场会使离子产生谐振，这一主要的势场分量可以被认为是离子的“长期频率”（也可以认为是在特定条件下特定离子的固有频率）。离子谐振的实际频率将主要由离子的m/z和Rf的驱动水平决定。

较低的M／二值产生较高的长期频率；可以同时被势阱俘获的离子质量范围可由一个稳定图来说明。稳定图（图12-8)是一个二维图，它表明了在什么样的特定势场内（包括Rf分量和施加在环电极和端盖之间的直流分量），一个特定m／z的离子的稳定与否。如图中的直线所标明的，如果以单一Rf模式工作，随着Rf驱动水平的增加，给定质量的离子在图上的相应稳定点将向右移动。较大质荷比（m/z)的离子位于较小质量离子的左边，即M₂>M₁。对于稳定区域内的任何一个给定点，某一离子会处在一个不同深度的势阱中，因而有一个特定的长期频率（动态固有频率）。

图12-8 Mathieu稳定图

从稳定图可以得出一个重要的推论，即截止质量的存在。图示表明沿着曲线q=1为一个离子能量稳定区域边界。如果一个离子接近了稳定区域的边界（q=0或q=1)，离子的运动轨迹将变得不稳定，因而会沿轴向离开离子阱。这意味着有一个最低的稳定质量和所有较低的不稳定质量共存于场内，于是同时存储于阱内离子的质量范围就有一个下限，即截止（cut-off)质量。截止质量取决于环电极上的Rf电压水平，同时也发现截止质量就是长期频率（secular frequency）接近Rf驱动频率的一半时该离子的质量。

理论上，可被存储的离子质量范围没有上限，但由于热力学的原因，对于实际使用是存在一个上限，这个上限是截止质量的20～30倍；超过此上限的离子不能被Rf场俘获。

4．离子阱中分辨率、质量范围和扫描速度的关系

离子阱的分辨率取决于扫描范围和扫描速度，当扫描速度为每秒几百个质量单位时，分辨率将小于四极杆质谱。但是如果以低扫描速度对很小的质量范围进行扫描时，分辨率可以增加。比如扫描范围为10Da时，分辨率可以达到5000，这个分辨率足以测定一个小分子肽的多电荷峰。

与四极杆质谱相比，由于在一定的分辨率要求下其扫描速度较慢，离子阱在相同时间下、相同的扫描质量范围内可采集到的数据点较少，因此它的定量精度比串级四极杆要差。这就是在定量测定为主的工作中优先考虑采用串级四极杆质谱的原因。

5．用离子阱完成质谱／质谱测定

用离子阱隔离一个感兴趣的特定离子的方法是，增加Rf电压以消除较低的质量数，调整端盖电极的电压以消除较高的质量数，这样就在一定质量范围内把特定一个或一些质量的离子驻留在阱中。

驻留于阱中的离子在增加Rf电压的作用下，以一种摇动（shaking）的方式分裂，然后被扫描得到它的二级质谱。由于每一个离子都有其自身的共振频率，所以产物离子不会被进一步分裂，导致有限但简明的质谱信息。为了得到更为丰富的质谱信息，发展了宽带活化（wide band activation)技术，此技术可用于离子阱质谱库的建立，但应用此技术得到的质谱与四极杆和三级四极杆所得到的质谱有所不同。

6.阱中电荷密度

离子阱的分辨率和状态取决于阱内离子的电荷密度，如果同一时间内阱内的离子过多，阱内的电场会扭曲，同时离子之间的碰撞会发生，导致不希望有的离子分裂或发生化学反应。在这种情况下会出现分辨率下降、质量精度下降和动态范围的下降，此时意味着阱内已经接近或达到了空间电荷极限（space charge limit)。因此在实际仪器设计中，一般都有累积时间（accumulation time）和阱内清除的编程功能。