高效液相色谱法(high performanc liquid chromatography，HPLC)具有灵敏度高、分离速度快、对抗生素残留能够准确定性和定量的特点，在β一内酰胺类、四环素类、磺胺类和氨基糖苷类抗生素残留的检测方面发挥着重要的作用，是目前广泛应用的一种抗生素残留检测方法。

    由于β一内酰胺类抗生素在结构上都含有羧酸基团，故早期采用阴离子交换柱来测定这类抗生素。但是所用流动相的pH往往低于维持抗生素残留稳定的pH，从而常常导致分离效果不理想，因此现在大都采用反相HPLC，常用的分析柱填料为ODS C18检测器为紫外检测器和荧光检测器。用反相HPLC检测时，由于多数青霉素化合物没有专一的紫外发色基团，其最大吸收一般在200～235nm，选择性差，背景干扰严重，因此可在咪唑或1，2，3-三唑催化下，使青霉素形成青霉烷酸硫醇汞衍生物，通过柱前衍生化，以提高紫外检测的灵敏度。此外，电化学检测器也可用于β一内酰胺类抗生素的检测。

    HPLC是四环素类抗生素残留分析最常用的方法。但采用硅胶基质的色谱柱时，由于四环素

类抗生素可与色谱系统中的金属离子形成螯合物，影响色谱行为；另外，四环素类抗生素可与固定相发生吸附，造成峰形不对称，使灵敏度下降。前者可通过在流动相中加入EDTA解决，后

者可通过对柱填料进行硅烷化或加入季铵盐等硅醇阻断剂来解决。四环素类抗生素在酸性水溶液中，在350～370 nm波长范围内有强的紫外吸收，因此可采用紫外检测器检测，检测灵敏度达μg/kg水平。由于四环素分子中含有两个共轭双键，因此在紫外光照下能产生荧光，它们的降解产物也具有荧光性质，因此，也可采用荧光检测器检测。但是用于四环素类抗生素的荧光检测器更多的是用于柱后荧光衍生化测定。例如，以二氯化氧锆(ZrOCl2，又称为氧氯化锆)作为荧光衍生剂，柱后荧光检测动物组织中四环素类抗生素残留，灵敏度可达pg水平，具有很高的灵敏度和很好的选择性。

    20世纪70年代初期，曾有人采用离子交换色谱、正相色谱或氧化铝吸附色谱分析磺胺类抗

生素及其分解产物。20世纪80年代后，人们普遍采用反相HPLC，使用C18(应用最广)、C8和苯基柱，以甲醇(或乙腈)一水(一冰醋酸或偏磷酸)为流动相，分离检测磺胺类抗生素及其分解产

物。HPLC的洗脱方式，一般采用等度洗脱，也可采用梯度洗脱，通过改变流动相流速和配比，

实现对多种磺胺类抗生素及其分解产物的分离。对于一般色谱柱难以分离的磺胺类抗生素，可使用β一环糊精化学键合固定相进行分离。由于磺胺类抗生素在250～290nm之间有强的紫外吸收，因此一般可以采用紫外检测器。为了提高检测灵敏度，也可以采用对二甲氨基苯甲醛进行柱后衍生，于450nm处进行紫外一可见光检测。磺胺类抗生素本身具有弱的荧光特性，当采用荧光检测时还需要荧光衍生化，常用的荧光衍生剂有邻苯二甲醛、苯胺和巯基乙醇等。    

    氨基糖苷类抗生素具有水溶性好、极性强和分子量大的特点，因此，这类化合物特别适合于用反相色谱或离子对色谱系统进行分析。由于氨基糖苷类抗生素各组分分子结构的差异小，且分子中无紫外发色团或荧光团，因此可以利用其结构中的活泼基团(如氨基、羰基)与衍生化试剂形成有紫外吸收或有荧光的物质，以便于紫外检测或荧光检测。衍生化方法可采用柱前衍生或柱后衍生。常用的柱前衍生化试剂有邻苯二甲醛、2，4一二硝基氟苯、2，4，6一三硝基苯磺酸和3，5一二硝基苯甲酰氯等，其中前三种衍生剂的衍生产物适用于紫外检测器，而后一种衍生剂的产物适用于荧光检测器。柱前衍生化方法的特点是较简单，不需要特殊的设备。柱后衍生化则采用在线技术，便于实现自动化测定，但需要有特殊的衍生化反应装置，因此目前常采用柱前衍生。