DNA加合物一般是指外源或者内源的亲电性化学物质与亲核性的DNA大分子发生反应而生成的共价加合物，是DNA损伤的一类重要形式。若形成的DNA加合物不能被DNA修复酶及时正确修复，可进一步引起关键基因的永久性改变（即发生突变），从而启动癌症的发展过程。DNA加合物可作为一种效应标志物，反映DNA受到有毒化学物质损伤的效应剂量。可靠、灵敏、准确的分析检测技术是DNA加合物作为生物标志物得到广泛应用的关键。当前DNA加合物分析、检测的方法主要包括：32P后标记法、免疫分析法、免疫毛细管电泳激光诱导荧光法、液相色谱串联质谱法、微分离质谱联用法。32 P-后标记法是1981/1982年由Randerath和Gupta等首先建立的一种DNA加合物检测分析方法，经过近年的发展与完善，目前已成为灵敏度最高、应用最为广泛的DNA加合物测定方法。

［原理］

经提取纯化得到的DNA样品在牛脾磷酸二酷酶(SPD）与微球菌内切酶(MN）作用下可完全水解成单核苷酸。加入核酸酶P1，选择地作用于正常未结合外来化学物的单核苷酸3'-OH末端，使之去磷酸化，而形成加合物的单核苷酸可抵制这一作用。再在反应体系中加入γ-32P ATP、多聚核苷酸激酶(T4 PNK)，未被P1作用的单核苷酸5’末端即可标上32P，而已去磷酸的单核苷酸则不能。当从反应混合液中取出30ul在PEI-cellulose层析板上分别进行D1,D2,D3,D4,D5五相薄层层析时，将正常核苷酸、游离的32P核素及各种加合物分离，经放射自显影确定各加合物在PEI-cellulose层析板上的位置，用液闪仪进行cpm计数，推算出其相对的加合物标记值（relative adduct labbling, RAL)。

【材料】

1．待检的培养细胞与对照细胞。

2. RNase A (20 ug/u1)。

3．蛋白酶K(20ug/ul)。

4．牛脾磷酸二酯酶（SPD 0.01 U/u1)。

5．微球菌内切酶(MN 0.1 U/ul）。

6.琥珀酸钠-氯化钙缓冲液（20mol/L琥珀酸钠，10mol/L氯化钙，pH 6.0)。

7．核酸酶Pl(5ug/ul)。

8. Bicine缓冲液（pH 9.6)。

9. T4多聚核苷酸激酶（T4PNK 2.5U/ul）。

10.[γ-32 P]ATP (6000 Ci/mmol)。

11. D1层析液（2.3 mmol/L NaH₂PO₄,pH 5.8)。

12. D2层析液（2.5mol/L甲酸铵,pH 3.5)。

13. D3层析液（3.Omol/L甲酸锂,8.5mol/L尿素，pH 5.3)。

14. D4层析液（0.6mo1/L LICI,O.5mol/L Tris,8.5mol/L尿素，pH 8.0)。

15. D5层析液（1.Omol/L NaH₂PO₄,pH 6.8）。

16．细胞裂解液（0.01 mol/L Tris-HCI, pH7.5,0.01 mol/L Na2EDTA,l% SDS,1 mg/ml链酶蛋白酶）。

17．饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）。

18．医用X线片、X线片暗盒。

19. PEI-cellulose薄层层析板、层析缸、高速台式离心机、-20℃及-80℃低温冰箱、紫外分光光度计、液闪计数仪、闪烁杯等。

【方法】

1. DNA的分离和纯化

(1)按实验设计与一定浓度化学物作用一定时间后收集细胞，溶于适量细胞裂解液中。

(2) 60℃水浴过夜。

(3）先用饱和酚，再用饱和酚：氯仿：异戊醇(25:24：1），氯仿：异戊醇（24：1)等体积各抽提1次。

(4）用2倍体积无水乙醇沉淀核酸。

(5）用RNase去除RNA。

(6)重复上述程序得到纯净DNA。置-20℃冰箱保存。

2. DNA水解取10ug DNA，加0.6U MN,0.1U SPD,琥珀酸钠-氯化钙缓冲液20 ul。混匀，37℃水浴22小时。

3．正常核苷酸3’末端去磷酸化加5ul核酸酶Pl,0.25mo1/L醋酸钠（pH 5.0) 12.5 ul及0.3 mmol/L氯化锌7.5ul。混匀，37℃水浴4小时。

4. [γ-32 P]ATP标记被修饰的核苷酸向上述管中加0.5mol/L Tris 5ul，bicine缓冲液(pH 9.6) 17.5ul,［γ-32 P] ATP74000MBq/ml (20uCi）及T4 PNK 15U。混匀，37℃水浴24小时。

5．薄层层析

(1)层析板预处理。在光面划线；钉上滤纸；双蒸水中预层析过夜；取出后用冷风吹干或自然晾干。

(2）点样30ul，将层析板浸入D1液中过夜，约18小时。取出层析板，剪去滤纸部分，置白瓷盘内振荡洗涤约15分钟，取出板吹干。

(3) D2层析，方向同D1，流动相移动至板上缘lcm为止，时间约1.5小时。取出层析板，在点样原点上方2.5cm处剪去上部层析板，置白瓷盘内震荡洗涤约15分钟，取出板吹干。

(4) D3层析，方向与D1,D2相反，流动相移至板上缘lcm为止，时间约2小时；取出层析板，沿中线剪开，置白瓷盘内振荡洗涤约15分钟，取出板吹干。

(5) D4层析，方向与D1,D2,D3垂直，加样点位于层析缸底部，流动相移至板上缘lcm处为止，时间约为1.5小时，置白瓷盘内振荡洗涤约15分钟，取出板吹干。

(6) D5层析，方向同D4，流动相移止板上缘lcm为止，时间约50分钟，置白瓷盘内振荡洗涤约15分钟，取出板吹干。

(7)将层析板放入塑料袋中，暗室内压片，-80℃冰箱内放射自显影3天。

(8）取出暗盒，暗室内显影、定影、自来水冲洗X片，晾干。

6．液闪液定量

(1)将层析板与X线片重叠，找出层析板中与显影斑相对应的区域，确定加合物位置。

(2）刮取层析板上加合物所在处的PEI-cellulose，放入闪烁杯中，同时刮取对照组相应位置同样大小的PEI-cellulose做本底对照。

(3）加入l0ml闪烁液，测其cpm。

【结果与分析】

说明：公式13-18中RAL：相对的加合物标记量（RAL);[γ-32 P] ATP比活换算为cpm/pmol，其换算系数为37000MBq (1uCi)=2.2x10cpm; 3240：常数，系每1ug DNA=3240pmol数；点样体积30 ul，总体积105.5 ul。

【注意事项】

1．制备无RNA污染的DNA。

2．采用酶消化分解时，要严格控制加入酶量的比例、试剂的pH以及消化孵育的时间。

近年来，人们对32P-后标记法的标准方法进行了改良。避免了其效率和灵敏度低的缺点。如限量APT法，在标记反应中限制加入ATP的量，由于被加合物的核苷酸优于正常的核苷酸，从而提高了灵敏度（107～108单核苷酸）；丁醇富集法，在将样品消化成3’-单核苷酸后，加入丁醇及反相试剂四丁基氯化铵，在酸性条件下抽提富集的被结合核苷，再进行标记。该方法由于样品中结合物经过了富集，故灵敏度进一步提高，可达109～1010单核苷酸；核酸酶Pl/S1富集法，在进行32P标记反应前，用核酸酶P1或Sl处理3’单核苷酸，正常3’-单核苷酸可以被核酸酶P1去磷酸化，从而不被T4多聚核苷酸激酶作用，而核酸酶P1不能使加合的核苷酸去磷酸化，这样在进行标记时就只有加合的核苷酸被标记上32P。与标准法相比，该法重现性好，灵敏度高，可达1个加合物／1010核苷酸，是目前使用较多的改良方法之一；HPLC富集法，利用HPLC法分离DNA样品的消化混合液，富集被加合的核苷酸，然后进行标记，进而用薄层色谱分离测定。此方法可把复杂混合物形成的DNA加合物分离开来，分别进行薄层色谱分离定性定量。但缺点是背景值较高，回收率偏低。此外，还有二核苷酸／5’-单磷酸法，该方法是用核酸酶P1和前列腺碱性磷酸酶(PAP)来消化DNA样品。其灵敏度高，有助于内源性及外源性加合物的定性定量分析，一般在富集法回收不完全的情况下使用。