单细胞凝胶电泳试验（single cellgel electrophoresis assay, SCGE )，又称彗星试验( cometassay)，是一种快速、灵敏、简便、价廉、重复性好的检测环境化学物对单细胞DNA损伤的方法。该方法于1984年首先由Dstling等建立，随后Singh等于1988年改进了实验条件，使之得以更广泛应用于毒理学、肿瘤学、放射生物学及环境和人群监测等方面。
DNA分子在断裂剂的作用下可出现单链或双链断裂，由于DNA形成紧密的超螺旋结构，检测这些断裂需要将双螺旋DNA分子解螺旋，在碱性条件下促使DNA变性和解螺旋，从而有利于单链和双链断裂的DNA在电场中移动，移动的距离与DNA断片分子量和电荷数量相关，经荧光染料染色后，在紫外线照射下发出荧光，使每个受损的细胞均呈现彗星样外观，明亮的头部为细胞核，一系列DNA断片组成彗星尾，尾巴的长度、密度、面积和荧光强度与诱变剂导致的DNA断裂数量成正比，因而通过测定彗尾的长度、面积及荧光强度来评价DNA损伤程度，未受损细胞只有细胞核—彗星核而无彗尾。在一定条件下，DNA迁移距离（彗星尾长）和DNA含量（荧光强度）分布与DNA损伤程度呈线性相关，因此，尾矩（尾部DNA的含量与尾长的乘积）成为定量测定单个细胞DNA损伤程度的主要依据。

【材料】

1．培养的待检细胞（3x10⁵个）。

2．正常熔点琼脂糖（NMA)。

3．低熔点琼脂糖（LMA)。

4. PBS（无钙镁）含0.15 mol/L NaCl, 0.71 mmol/L KH₂P0₄和4.28mmol/L K₂HPO₄。

5．细胞裂解液含2.5mol/L NaCl, 100mmo1/L EDTA,10mmol/L Tris, l% TritonX-100和10% DMSO，pH=10。

6．碱性电泳液10mol/L NaOH 30ml,200mmo1/L EDTA5m1，定容至1000m1, pH = 13 。电泳前新鲜配制。

7．中和缓冲液（0.4mo1/L Tris)Tris48.5g溶于去离子水，定容至1000m1。用HCl调pH至7.5。

8.溴化乙锭（EB）染色液（10x)lmg EB溶于50m1去离子水，临用时10倍稀释。

9．乙醇。

10．全磨砂载玻片、1号盖玻片（24mmx50mm)。

11．电泳仪、电泳槽、荧光显微镜、彗星图像分析软件。

【方法】

1．细胞准备3x10⁵细胞接种于25cm²培养瓶，80％～90％融合时给予不同浓度受试物，达到要求的时间后，消化收集细胞，PBS洗两次，细胞重悬于PBS备用。

2．制胶板层凝胶制备：将全磨砂玻片预热45℃，磨砂面向上置45℃水浴锅或加热板上，将预热40℃完全溶解的100ul无钙镁PBS液制备的1％正常熔点琼脂糖溶液均匀的滴在磨砂玻片上，防止气泡产生，迅速盖上干净的1号盖玻片，置4℃冰箱中10分钟使NMA凝固。

(1)第二层凝胶制备：将20ul含有10³～10⁴个受检细胞的PBS细胞悬液和75ul含0.5％无钙镁PBS溶液分别在37℃下预热并混匀，继之取出第一层凝胶片，轻轻揭去盖玻片（注意防止揭坏或使第一层凝胶脱落），迅速将上述混合液滴加在第一层凝胶片上，立即盖上1号盖玻片，置4℃冰箱放置10分钟，使第二层凝固。

(2）第三层凝胶片制备：取出第二层凝胶片，轻轻揭去盖玻片，迅速向上滴加75ul LMA加上盖玻片，4℃ 10分钟凝固。

3．细胞裂解移去胶片上的盖玻片，将载玻片水平浸入（胶片朝上）新配制的预冷的细胞裂解液中，至少裂解1～2小时。

4. DNA碱解旋将载玻片从裂解液中取出，用吸水纸吸干裂解液并列置于水平电泳槽阳极端，电泳槽中加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液，将覆盖载玻片胶面0.25cm左右，放置40分钟，以使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移。

5．细胞电泳在电压25V，电流强度300mA下，电泳20～40分钟，电压和电流可用改变电泳液液面的高低来调节。

6．漂洗电泳后将载玻片置于平皿内，缓缓沿壁加入0.4mmo1/L Tris-HCI (pH7.5)缓冲液或双蒸水，漂洗2次，每次5～15分钟，弃去Tris-HCI或双蒸水，使用PBS洗干净，并用滤纸吸干水分。再缓缓加入无水乙醇将凝胶浸埋脱水10分钟～1小时之后，吸去乙醇，自然晾干或室温下过夜，晾干。

7．染色每张载玻片加2～3滴染色剂（常用30ul溴化乙锭溶液染色），盖上盖玻片（也可以不盖上），避光染色20分钟。盖上盖玻片的目的是可以隔日分析，或便于操作。

8．阅片及拍照荧光显微镜515～560nm（绿光）波长的激发光，可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA（即彗星尾）。每个样本随机选择20～100个细胞，图片保存后，用相应的软件分析结果。

【结果与分析】

1．镜下每张片随机计数100个细胞，计算彗星细胞出现频率，计算在整个观察细胞中有彗尾的细胞占总观察细胞的百分率。也可计算每个细胞拖尾占其体积的百分率对DNA损伤程度进行主观分级评分。见表13-6。

2．采用目镜测微尺，每片计数25～50个细胞，每组2～3张玻片，测量头长与尾长，计算拖尾率。

3．用专业的单细胞凝胶电泳实验分析软件对图像进行分析。测定慧星尾长、尾面积、尾距、尾积分。

【注意事项】

1．制备胶板注意事项

（1)磨砂玻片必须质量好，完全磨砂，防止胶片脱落。

(2)磨砂玻片必须预热40～45℃，使凝胶结合牢固。

(3）加入凝胶时，最后在Tip中的凝胶不用吹下，防止产生气泡。

(4）加盖玻片时防止气泡产生。

(5) 1号盖玻片必须先用乙醇浸泡脱脂，然后在无水乙醇中浸泡，并用滤纸擦干，这样防止盖玻片与凝胶胶着不易揭去，揭盖玻片时必须小心防止揭破胶片，前功尽弃。

(6）胶片操作必须轻拿轻放，防止胶片脱落。

2．裂解时间最少1小时，根据细胞种类可在1～2小时波动，也可过夜，但防止裂解液形成沉淀影响结果。

3．碱解DNA螺旋的pH最好为12，碱解时间不能少于20分钟，过长亦可影响彗尾长度，一般控制在20～40分钟。

4．电泳后的载玻片上的胶板一定用Tris-HCI缓冲液中和至中性，然后方能染色。

5．上述各项操作均应在暗室黄光或红光下操作，以避免额外的DNA损伤。