神经细胞培养技术是神经药理学领域的一项重要技术，是开发和研究神经系统药物的重要手段。与其他细胞培养技术相比，技术难度大，要求条件高。尽管各个实验室所用条件和方法不尽相同，但培养时均应注意：防止微生物的污染，保持pH相对稳定，尽量缩短操作时间，选用优质血清和选择合适的生长、分化条件等措施提高神经细胞的存活率。原代神经细胞培养主要包括神经元及神经胶质细胞培养。神经元培养对营养条件的要求较高，培养基已经商业化可直接购得，在选用血清问题上推荐使用公认、质量较为稳定的优质胎牛血清，有利于神经元的存活。

神经干细胞增殖和分化实验

【原理和目的】

神经干细胞（neural stem cell, NSC）是指具有分化为神经元、星形角质细胞和少突胶质细胞潜能，并具有自我更新能力的一类细胞。近年来神经干细胞已成为神经生物学，神经药理学的研究热点之一。这类细胞可以自我增殖、分化、迁移，形成成熟的神经元或神经胶质细胞，即存在神经元再生现象，而新生的神经元和神经胶质细胞对于维持大脑正常的生理功能至关重要。近年来的研究证实，多种神经系统疾患包括脑损伤、神经退行性疾病、抑郁症等的发生均与神经元再生密切相关。促进神经元再生可能是多种神经系统药物（脑保护药，抗抑郁剂等）共同的作用机制之一。

哺乳动物胚胎期，神经干细胞主要分布在大脑皮质、纹状体、海马、室管膜下层（subven-tricular zone, SVZ）和中脑等区域；成年后，主要局限在室管膜下层和海马齿状回颗粒下层区域（subgranular zone, SGZ )。目前体外神经干细胞的分离方法主要从胚胎或成年动物的脑中取材，将所取的脑区组织进行解离分散，形成几个至几千个细胞组成的小圆团块组织（神经球），最后将细胞暴露于含有高浓度的促细胞分裂剂如碱性成纤维细胞生长因子或表皮生长因子中，增殖至一定数量后，加入适量的待测药物孵育，可采用 MTT法，CCK-8法，³H-TdR掺入法等考察药物对神经干细胞增殖的影响。撤除神经干细胞培养基中的表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子并同时加入10％的胎牛血清，可诱导神经干细胞分化为神经元或神经胶质细胞，分化过程中加入待测药物，采用免疫细胞化学法检测药物对神经干细胞分化的影响。通过考察药物对神经干细胞增殖和分化的影响，初步筛选其对神经系统作用或探讨其作用机制。

目前神经干细胞分离方法有3种：①免疫磁珠细胞分选法：利用神经干细胞表面抗原特异性，在磁场作用下使能与表面具有特异性抗体的磁珠结合的神经干细胞分离出来，从而使神经干细胞得到分离纯化；此法具有便捷、分离纯度高和分离容量大等优点，是目前较为推崇的神经干细胞分离方法；②反复传代法：取新生动物或适当周龄动物的胚胎大脑或脑区，机械分离制作单细胞悬液，在含有多种神经因子的无血清培养基中培养，经过长期反复传代可获得纯化的神经干细胞；此法操作步骤多、耗时，但所需设备简单，便于开展，目前仍为常规的神经干细胞分离方法；③流式细胞检测法：应用流式细胞技术分选出具有CD³³⁺/CD³⁴⁺/CD^45-细胞表面抗原的神经干细胞；此法所需设备昂贵，技术要求较高，而获得的神经干细胞纯度不高。本节中以新生大鼠反复传代法为例介绍神经干细胞的分离、培养、鉴定和分化及其在药物研究中的应用。

【材料】

1．新生24小时内的Wistar大鼠。

2．主要试剂胰蛋白酶、进口胎牛血清、DMEM/F12培养基、N2添加剂、B27添加剂、表皮生长因子（Epidermal growth factor, EGF)、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF) ,MTF,CCK-8试剂盒、³H-胸腺嘧啶核昔(³ H-TdR )、兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白、兔抗大鼠巢蛋白单克隆抗体、羊抗免-cy3荧光二抗等。

3．主要仪器超净化工作台、C0₂孵箱、倒置相差显微镜、荧光显微镜、液体闪烁计数仪、96孔扫描分光光度计等。

【方法】

1．神经干细胞的分离、培养及鉴定无菌剥离新生大鼠的全脑，置于冰冷的D-Hanks液中冲洗，解剖显微镜下分离双侧海马组织，用眼科剪刀剪成糜状，0.125％胰蛋白酶37℃消化20～30分钟，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止胰酶的作用，离心后将细胞悬浮于神经干细胞培养液（DMEM/F12+2% B27添加剂+1% N₂添加剂+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF+2mmol/L谷氨酰胺+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素）中，再次离心（1000r/min,10分钟）去除胰酶和血清后，过200目细胞筛，得到单个细胞悬液，锥虫蓝染色检测细胞存活率，保证细胞的存活率在95％以上。调整细胞浓度以(7～8)x10⁵/ml的密度，将细胞接种于多聚赖氨酸（polylysine, PLL）处理的T25培养瓶中，每3天半量换液1次，换液时需离心(1000r/min,10分钟），去半量上清液，重新加入半量新的神经干细胞培养液，7天传代，收集神经球，巴斯德管轻柔将神经球吹打成单细胞，接种密度为（3～5)x10⁵/ml。

2．实验设计

(1)药物对神经干细胞增殖作用的影响：选取第2代生长良好的神经干细胞即可直接接种在96孔或24孔板中培养，待细胞融合即可实验。通常把细胞孔分成正常组（不加药）和若干给药组（加不同剂量药物）。给药组细胞首先给含药培养液，培养数小时（一般4～72小时内），然后进行形态学观察，采用MTT法、CCK-8法和³H-TdR掺入法检测药物对神经干细胞增殖的影响。

(2）药物对神经干细胞分化的影响：吸出培养瓶中的神经球，离心撤除丝裂原，将沉淀重悬于神经干细胞分化培养基中（DMEM/F12+2% B27添加剂+1%N₂添加剂+2mmo1/L谷氨酰胺+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素+10％胎牛血清），同样接种于含PLL处理过的盖玻片的六孔板中，给药组中加入不同浓度的待测药物，正常组（不给药）加入同等体积的PBS。48～72小时换液1次（维持待测药物的浓度）。培养6～7天终止培养，于倒置显微镜下观察形态，并进行细胞免疫化学染色检测药物对神经干细胞分化的影响，实验流程见图11-29。

【结果与分析】

1．神经干细胞的鉴定

(1)形态学观察：将新生大鼠海马组织的单细胞悬浮于神经干细胞培养基，接种于25 ml的细胞培养瓶内观察。刚接种的细胞为圆形，大小不一，边缘发亮，折光性强。培养第2～4天，部分细胞死亡，可见大量细胞碎片；培养液内可见数个细胞组成的细胞团（或称神经球），如典型的两个细胞连接成的哑铃形；随着培养时间的延长（大约至1周时），神经球的体积与数目不断的增多，它们悬浮生长，形态规则，没有明显的突起。若将神经球用吸管吹打成单细胞或小细胞团，传代培养，传代细胞经5～7天又可以形成神经球（图11-30) ;

(2）化学标志物：巢蛋白（nestin )是一种中间丝蛋白，是神经上皮干细胞特异性表达的分子标志物。可采用巢蛋白免疫荧光法染色进行神经干细胞的鉴定（图11-31A)。

2．神经元的鉴定

(1)形态学特征：一般情况神经细胞接种14～16小时后多数细胞贴壁，24小时后形成粗细不一的突起；细胞体逐渐变大，突起伸长变粗，并逐步发出分支相互连接，交织成网，光晕不断扩大。当神经细胞受损后，形态发生改变，表现为细胞皱缩变形或胞体肿胀；膜结构的改变，出现空泡和（或）膜表面微绒毛缺失或变形；进一步损伤时，细胞膜可裂解，内容物释放，同时尚可出现线粒体肿胀、内质网肿胀及脱颗粒等细胞器改变，细胞核固缩、破裂甚至分解；损伤后突起可出现树突截断、碎裂甚至缺失。

(2)化学标志物：成熟的神经元标志物为特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)，烯醇化酶有α，β，γ组成的5种二聚体同工酶，其中γ型特异性的存在于神经元和神经内分泌细胞中，被视为神经元特异性烯醇化酶(NSE)。同时NSE也是神经元损伤敏感性标志物，可作为神经元损伤程度的标志（图11-31 B)。

A．为神经干细胞的Nestin染色；B．为神经元NSE染色；C．为星形胶质细胞的GFAP染色；D．为少突胶质细胞的MBP染色，