在血栓形成过程中，血小板的黏附和聚集功能主要依赖于血小板膜糖蛋白（GP）与血浆黏附蛋白之间的相互作用，其中，GP Ⅱb/Ⅲa在血小板聚集过程中起着重要作用。血小板在各种诱导剂作用下或接触受损血管壁时，发生活化反应过程中GP Ⅱb/Ⅲa变构而形成纤维蛋白原的受体，从而促使血小板相互聚集最终形成血栓。

目前已有多种阻断血小板GP Ⅱb/Ⅲa受体和纤维蛋白相互作用的药物产生。此类药物作用于血小板GP Ⅱb/Ⅲa受体，能有效抑制血小板聚集，因此具有显著的抗血栓作用。

进行抗血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体试验用以研究受试药物是否以GP Ⅱb/Ⅲa为拮抗靶点而发挥抗血小板、抗血栓作用，包括核素标记法和流式细胞仪法两类方法。

核素标记法是以核素标记纤维蛋白原，实验中，血小板GPRb/RIa在ADP等诱导剂作用下形成纤维蛋白原受体，与核素标记的纤维蛋白原相结合，加入血小板GP Ⅱb/Ⅲa拮抗剂Ticlid，可抑制GP Ⅱb/Ⅲa与标记纤维蛋白原的结合。

流式细胞仪法是以荧光素（FIX）标记抗纤维蛋白原单克隆抗体，实验中，血小板GP Ⅱb/Ⅲa在ADP等诱导剂作用下形成纤维蛋白原受体，与纤维蛋白原相结合，加入荧光素标记的抗纤维蛋白原单克隆抗体，即可通过流式细胞仪测定出与纤维蛋白原相结合的血小板数目（％）及结合强度。而加入血小板GP Ⅱb/Ⅲa拮抗剂Ticlid，可抑制GP Ⅱb/Ⅲa与纤维蛋白原的结合。

【材料】

1. 125I-纤维蛋白原；FITC-抗纤维蛋白原单克隆抗体。

2. ADP诱导剂。

3．阳性对照药GP Ⅱb/Ⅲa拮抗剂Ticlid。

4．抗凝剂 ACD抗凝剂（0.8 g枸橼酸，2.2g枸橼酸三钠和2.45g葡萄糖溶于l00ml蒸馏水中，用前加入终浓度分别为25 ug/ml Apyrase和20 umol/L前列腺素E1);3.8％枸橼酸钠。

5．台氏液（NaCl 138 mmol/L, KC1 29 umol/L, NaHC0₃ 12 umol/L , NaH₂P0₄ 0.3 mmol/L，葡萄糖5umol/L,pH 7.4)。

6．蔗糖分离液（20g蔗糖溶于l00ml含有0.35％牛血清清蛋白的台氏液中）。

7. HEPES缓冲液（HEPES l0umol/L, NaCl 145 umol/L, MgS0₄ 1umol/L, pH 7.4)。

8. FBS过滤缓冲液（HEPES缓冲液加入0.2％多聚甲醛，过滤）。

9．放射性核素检测仪，流式细胞仪。

【方法】

1．核素标记法

(1)制备洗涤血小板：取全血，以ACD为抗凝剂抗凝，抗凝剂与血的比例为1:4.5，离心（500r/min,10分钟），分取上层获PRP，将PRP高速离心（2000r/min,10分钟）得血小板沉淀，以台氏液悬浮并洗涤2次，最后以含0.35％牛血清清蛋白的台氏液悬浮并调血小板计数至1.5x10⁶/ul备用。

(2) 125I-纤维蛋白原结合试验：试验设给药管、对照管和空白管。各管均加入360ul血小板悬液，给药管加入450ul含有400umol/L Ticlid或受试药物的含0.35％牛血清白蛋白的台氏液，对照管及空白管加入不含药的含清蛋白台氏液。室温下反应30分钟后，加入125I-纤维蛋白原（1.0×10cpm）和诱导剂ADP（终浓度10 umol/L )，空白管不加ADP，使各管终体积为1m1。混匀，室温下反应30分钟后，每管取3份样品（250ul）悬浮于 500ul蔗糖分离液中，高速离心（14 000r/min,2分钟），沉淀为结合纤维蛋白原的血小板，上层为悬浮于蔗糖液面的游离125I-纤维蛋白原。吸弃上清液，将含血小板沉淀的离心管底切下，测定其放射性强度(cpm)。按下式计算纤维蛋白原结合抑制百分率：

1%=（1-给药管cpm/对照管cpm)x100

2．流式细胞仪法

(1)稀释全血：取全血，以枸橼酸钠或ACD为抗凝剂抗凝，抗凝剂与血的比例分别为1:9或1:4.5，将抗凝血以HEPES液稀释，血与稀释液比为1:9。

(2) FITC-纤维蛋白原结合试验：试验设给药管、对照管和空白管，每管均设阴性对照管。各管均加入50ul稀释全血，给药管加入10ul含有Ticlid或受试药物的HEPES液，对照管及空白管加入10ulHEPES液。室温下反应30分钟后，加入FIX-纤维蛋白原和诱导剂ADP终浓度10 umol/L)，空白管不加ADP，阴性对照管均以等量FITC-鼠IgG代替FITC-纤维蛋白原。混匀，室温下反应30分钟后，每管加入0.5ml FBS悬浮细胞。用流式细胞仪检测，识别血小板，设置血小板门，收集5000～10000个血小板，读出FITC-纤维蛋白原结合的血小板数目（％）。按下式计算抑制百分率：

1％=（1-给药管测定值／对照管测定值）x100

【结果与分析】

按上式计算受试药物的纤维蛋白原结合抑制百分率，且受试药物应设不同浓度，绘制量效曲线，以观察药物抑制GP Ⅱb/Ⅲa与纤维蛋白原结合的剂量依赖性，并计算IC_5O。

【注意事项】

1．阳性对照药也可采用其他GP Ⅱb/Ⅲa拮抗剂，如阿昔单抗、依替巴肽等。

2．制备洗涤血小板过程复杂，血小板易被激活而发生自发性聚集，因此，操作时动作应轻柔。

3. FITC-纤维蛋白原结合试验中各管均设阴性对照管。