血栓调节蛋白（thrombomodulin, TM）是分子量约为75kD的糖蛋白，由内皮细胞和巨核细胞合成，存在于内皮细胞和血小板膜表面。当凝血酶与TM形成复合物后，可激活蛋白C,活化的蛋白C能灭活凝血因子Va和Ⅷa，从而抑制凝血反应。

蛋白C的活性与TM浓度成正比，在反应体系中加入特殊的底物，经蛋白C作用，释放出PNA, PNA呈黄色，可通过测定波长405 nm处的OD值来计算TM的活性。

【材料】

1．体外培养的血管内皮细胞。

2．抗凝剂枸橼酸钠。

3．平衡缓冲液（20mmol/L Tris-HCL,0.15mol/L NaCl, 1mmol/L苯甲脒，0.2% NP40,pH 7.4)；洗脱液（20mmo1/L Tris-HCI, 2mo1/L NaSCN, 0.2%NP40, pH 7.4 )；缓冲液(50mmo1/L Tris-HC1,0.1mol/L NaCl, 3mmo1/L CaCl₂,0.1％ BSA，pH 7.5）

4.酶标仪、透析袋。

【方法】

1．体外血管内皮细胞培养。

2．浓缩血浆及尿液由于血浆及尿液中的TM含量很低，测定其活性前需先用亲和层析浓缩样品。血浆或尿液装入透析袋，放入500ml平衡缓冲液中于4℃透析4小时，然后上样，层析柱为抗TM IgG-Sepharose 4B柱，上样后用平衡液冲洗20分钟，然后用洗脱液洗脱，得TM洗脱峰，放入缓冲液中，透析8小时，共2次，浓缩后的样品用于下列测定。

3．测定步骤

(1)内皮细胞：培养在24孔板上的内皮细胞用PBS洗三次，然后加入100u1的PBS和100 ul的单克隆抗体，1小时后，去掉上清液，再加入100 u1的PBS ,10 ul凝血酶，30秒后，加入20 ul蛋白C,（凝血酶的终浓度为3 nmol/L，蛋白C的终浓度为50nmol/L)，培养板加盖，于37℃缓慢振荡下孵育90分钟，加入5ml 70nmo1/L的水蛭素终止蛋白C的激活，取40ul上清液，加100ul 3.75nmo1/L的蛋白C底物S2366,37℃显色10分钟，加入200ul冰醋酸终止反应，405 nm处测定光吸收。

(2)血浆（尿液）中TM测定及标准曲线制备：在24孔板中，分别加入100ul血液（尿液）或不同浓度的TM标准品，每孔中标准品含量为0～600ng，再加入10ul凝血酶,30秒后，加入20ul蛋白C，其余步骤同上法，显色后于波长405 nm处测定OD值，以TM浓度为横坐标，OD值为纵坐标制备标准曲线。

【结果与分析】

培养内皮细胞表面的TM活性测定法主要用于基础研究，也可用来测定血浆及尿液中的TM，但测定前，血、尿样品均需浓缩。TM增高可见于糖尿病、DIC、急性心肌梗死、脑血栓等，此法除用于药效学研究外，临床上也可用于一些疾病的辅助诊断。

【注意事项】

样品采集后，若当天不测定，应加1 mmol/L苯甲胺，置-20℃冰箱保存。复溶时应在37℃水溶中快速解冻，缓慢解冻将导致TM沉淀。