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血管内皮细胞不但分泌t-PA, u-PA,而且分泌纤溶酶原激活物抑制剂(PAI),以拮抗t-PA, u-PA的纤溶作用,这对维持纤溶系统的平衡具有重要意义。 PAI是一个由379个氨基酸组成的单链糖蛋白,分子量为5万左右,它能与t-PA (u-PA)结合成紧密的复合物,从而抑制t-PA及u-PA的活性。
PAI可与加入定量的纤溶酶原激活物(t-PA或u-PA)形成无活性的复合物,未与PAI结合的t-PA或u-PA可使纤溶酶原转变成纤溶酶,纤溶酶作用于发色底物S-2251,使其分解后释放出对硝基苯胺(PNA),PNA呈黄色,通过测定光密度,即可计算出样本中纤溶酶的含量,而纤溶酶含量与PAI活性呈负相关,由此间接测定PAI水平。
【材料】
1.体外培养的血管内皮细胞;
2.抗凝剂枸橼酸钠;
3.纤溶酶、氯胺T溶液、发色底物S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-PNA )、醋酸;
4.酶标仪。
【方法】
1.常用方法一
(1)制备标本:制备枸橼酸钠抗凝血浆或内皮细胞培养液。
(2)测定步骤:枸橼酸钠抗凝血浆或内皮细胞培养液20ul,加入20ul 2.5 IU/ml u-PA混匀,37℃孵育5分钟,加入20ul 15 U/ml纤溶酶,20ul 8mmol/L氯胺T溶液混匀,37℃孵育5分钟,加入50ul 0.6mmo1/L发色底物S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-PNA )混匀,孵育5分钟,加入20u l20%醋酸终止反应。于波长405 nm处测OD值,同一块板上制备标准曲线,标准PAI浓度为0~4U/ml。
2.常用方法二
(1)制备标本:同上。
(2)测定步骤:按下表11-5,在96孔板的第1,2列加入样品管反应液,第3、4列加入对照管反应液。
充分混匀后,立即在酶标仪上,测定波长405 nm处的OD值,96孔板加盖,25℃孵育4小时。再次测定OD值。
【结果与分析】
1.结果按下式计算
△OD样品管=ODt样品管-OD0样品管
△OD对照管=ODt对照管-OD0对照管
注:OD0为孵育前的OD值,OD为孵育t小时后的OD值。
分别以△OD样品管/t2及△OD对照管/t2对加入t-PA量作图,可得两条如图11-28所示的曲线,样品管曲线的直线部分应与对照管直线平行。将样品管曲线的直线部分延长至与X轴相交处,即为样品管中的PAI活性。
2.方法一 通过测定u-PA的活性间接反应PAI含量,故除用于测定PAI外,还可用于测定u-PA活性。
3.方法二 较方法一精确,即使存在高浓度的纤溶酶抑制剂(如a2抗纤溶酶)也不影响结果,可能是纤维蛋白原片段对纤溶酶及t-PA的保护作用所致。
PAI含量增高可见于高凝状态或血栓栓塞性疾病,故该法可用于药效学的研究及前述这些疾病的辅助诊断。
【注意事项】
1.采用方法一要注意血浆与u-PA温育时间必须准确。
2.采用方法二要注意PAI不稳定,25℃测定比37℃测定更可靠,但孵育时间要比37℃长4倍。
注:不同量的t-PA加入缓冲液(▲)或加入含10ul血浆的缓冲液(O)中,以t-PA活性对加入的t-PA量作图,将含t-PA血浆缓冲液直线部分用虚线延长至与X轴相交;即可求得PAI活性。本图所示PAI活性为86mlU/10ul血浆或8.61U/ul血浆
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