血管内皮细胞不但分泌t-PA, u-PA，而且分泌纤溶酶原激活物抑制剂（PAI)，以拮抗t-PA, u-PA的纤溶作用，这对维持纤溶系统的平衡具有重要意义。 PAI是一个由379个氨基酸组成的单链糖蛋白，分子量为5万左右，它能与t-PA (u-PA）结合成紧密的复合物，从而抑制t-PA及u-PA的活性。

PAI可与加入定量的纤溶酶原激活物（t-PA或u-PA）形成无活性的复合物，未与PAI结合的t-PA或u-PA可使纤溶酶原转变成纤溶酶，纤溶酶作用于发色底物S-2251，使其分解后释放出对硝基苯胺（PNA),PNA呈黄色，通过测定光密度，即可计算出样本中纤溶酶的含量，而纤溶酶含量与PAI活性呈负相关，由此间接测定PAI水平。

【材料】

1．体外培养的血管内皮细胞；

2．抗凝剂枸橼酸钠；

3．纤溶酶、氯胺T溶液、发色底物S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-PNA )、醋酸；

4.酶标仪。

【方法】

1．常用方法一

(1)制备标本：制备枸橼酸钠抗凝血浆或内皮细胞培养液。

(2)测定步骤：枸橼酸钠抗凝血浆或内皮细胞培养液20ul，加入20ul 2.5 IU/ml u-PA混匀，37℃孵育5分钟，加入20ul 15 U/ml纤溶酶,20ul 8mmol/L氯胺T溶液混匀，37℃孵育5分钟，加入50ul 0.6mmo1/L发色底物S-2251（H-D-Val-Leu-Lys-PNA )混匀，孵育5分钟，加入20u l20%醋酸终止反应。于波长405 nm处测OD值，同一块板上制备标准曲线，标准PAI浓度为0～4U/ml。

2．常用方法二

(1)制备标本：同上。

(2)测定步骤：按下表11-5，在96孔板的第1,2列加入样品管反应液，第3、4列加入对照管反应液。

充分混匀后，立即在酶标仪上，测定波长405 nm处的OD值，96孔板加盖，25℃孵育4小时。再次测定OD值。

【结果与分析】

1．结果按下式计算

△OD样品管=ODt样品管-OD0样品管

△OD对照管=ODt对照管-OD0对照管

注：OD0为孵育前的OD值，OD为孵育t小时后的OD值。

分别以△OD样品管／t²及△OD对照管／t²对加入t-PA量作图，可得两条如图11-28所示的曲线，样品管曲线的直线部分应与对照管直线平行。将样品管曲线的直线部分延长至与X轴相交处，即为样品管中的PAI活性。

2．方法一 通过测定u-PA的活性间接反应PAI含量，故除用于测定PAI外，还可用于测定u-PA活性。

3．方法二 较方法一精确，即使存在高浓度的纤溶酶抑制剂（如a2抗纤溶酶）也不影响结果，可能是纤维蛋白原片段对纤溶酶及t-PA的保护作用所致。

PAI含量增高可见于高凝状态或血栓栓塞性疾病，故该法可用于药效学的研究及前述这些疾病的辅助诊断。

【注意事项】

1．采用方法一要注意血浆与u-PA温育时间必须准确。

2．采用方法二要注意PAI不稳定，25℃测定比37℃测定更可靠，但孵育时间要比37℃长4倍。

注：不同量的t-PA加入缓冲液（▲）或加入含10ul血浆的缓冲液（O）中，以t-PA活性对加入的t-PA量作图，将含t-PA血浆缓冲液直线部分用虚线延长至与X轴相交；即可求得PAI活性。本图所示PAI活性为86mlU/10ul血浆或8.61U/ul血浆