直接用血浆是测不出t-PA活性的，因为血浆中含有抑制物，通过分离血浆优球蛋白部分，可去除大部分的抑制物。血浆优球蛋白部分除t-PA外，还有其他纤溶酶原激活剂（如u-PA，因子X依赖性PA）及蛋白水解酶，这些物质会干扰t-PA的测定，因此，t-PA的活性只能通过测定在过量抗t-PA IgG存在下（不含t-PA活性，即表11-4中的空白管）与抗t-PA IgG不存在条件下（含t-PA活性，即表11-4中的反应管）的纤溶活性差值来特异性地反映。反应体系中加入可溶性的纤维蛋白（原）片段，可增加t-PA的活性，缩短测定时间。同理，用抗u-PA IgG，即可测定u-PA的活性。

【材料】

1．体外培养的血管内皮细胞；

2．抗凝剂枸橼酸钠；

3.醋酸、Tris-Tween缓冲液（0.1mol/L Tris-HC1,0.1% (V/V）吐温80, pH 7.5)；

4．酶标仪。

【方法】

1．体外血管内皮细胞培养。

2．制备枸橼酸钠抗凝的血浆。

3．操作步骤 取枸橼酸钠抗凝血浆0.2ml，加入1.8m1蒸馏水稀释，在缓慢振摇下，加入0.1ml 0.25% (V/V)的醋酸，使pH在5.7～6.2之间，以上操作均在0℃下进行，并将样品在0℃下放置30分钟，离心（2000xg,10分钟，4℃)，弃去上清液并将离心管倒置以去除残余的上清液。沉淀用0.2ml Tris-Tween缓冲液溶解。所得优球蛋白部分可立即用于以下测定或在-70℃保存数天。

测定步骤如下表11-4。

充分混匀后，立即于酶标仪中，测定波长405nm处的OD值，96孔板加盖，37℃孵育4小时，混匀，再测定OD值。

【结果与分析】

1．制备标准曲线制备每孔含标准t-PA 0～60mIU（毫单位）的标准曲线。

2．按下式计算结果（每个样品测3复孔，取平均值）

△OD反应管＝ODt反应管-OD0反应管

△OD空白管=0Dt空白管-OD0空白管

△OD=△OD反应管-△OD空白管

注：OD0为孵育前的OD值，ODt为孵育t小时后的OD值。

以△OD对t-PA浓度作图，得标准曲线。如果样品中t-PA活性很低，可将反应时间延长到24小时或更长，不同反应时间的活性可用△OD/t²进行比较，即以△OD/t²为纵坐标，t-PA浓度为横坐标绘制标准曲线。

3．此法测定t-PA活性的灵敏度高，特异性强，可测定生理状态下极低的t-PA活性，并可常规操作。

此方法可用于测定血浆中，内皮细胞培养液及内皮细胞提取物中的t-PA活性。用于药物影响下或临床某些疾病状态下t-PA活性的测定。

【注意事项】

1．由于t-PA活性的不稳定及血液中的抑制物的存在，优球蛋白部分的提取需在低温下进行。

2．纤溶酶抑制剂（如抑肽酶）及高盐浓度（终浓度＞0.2mol/L)可使t-PA的测定值偏低，在这种情况下，可通过减少样品的量，增加反应时间来减少偏差。