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肝脏是生理和病理状态下能量代谢、毒素的生物转化以及血浆蛋白合成的中心器官,是机体最重要的器官之一。肝损伤是由各种肝脏疾病所产生的病变结果。临床上造成急性肝损伤的原因有病毒感染、药物毒性、乙醇、食物中毒、缺血缺氧、放射性损伤等。培养体系中的肝细胞可以很好地模拟体内肝脏生理环境,作为研究肝特异代谢过程和肝脏功能的重要工具。通过建立实验性急性肝细胞损伤模型,可以直接观察药物的保肝作用,进行保肝药物的筛选,并探讨药物的保肝作用机制。
[原理和目的]
肝细胞培养分为原代培养和传代培养。绝大多数原代肝细胞培养在大鼠中进行。分离原代肝细胞的方法有机械分离法、胶原酶分离法、胰蛋白酶消化法、含鳌合剂的无钙离子溶液灌注法、酸性磷酸盐灌注法等,其中两步胶原酶灌注是原代肝细胞分离的经典方法。原代肝细胞的培养较难,且一般只能传至10代左右,细胞即停滞生长,大部分衰老死亡,只有少数细胞能存活到40~50代。传代的肝细胞培养简单且可多次传代,易于实验,实验中也可用传代的肝细胞代替原代肝细胞,常用的传代肝细胞有HepG2和L02等,其中L02更贴近于体内肝细胞的特性而常用于实验研究。
将分离的原代肝细胞或传代肝细胞置于适宜的培养液中进行培养,以肝细胞损伤剂造成细胞损伤。损伤剂可用四氯化碳(CCL4) ,D-氨基半乳糖(D-GL)、对乙酰氨基酚(APAP),硫代乙酰胺(TAA)、对醋氨酚(AAP)、缺氧/复氧( hypoxia-reoxygenation, H/R)等。肝脏缺血再灌注是急性肝损伤的一种,利用体外培养肝细胞缺氧/复氧模型,模拟在体肝脏缺血/再灌注损伤,既可使肝细胞不受邻近细胞相互作用和生理反馈机制等因素的影响,又可直接观察到抗急性肝损伤药物对肝细胞的作用。下文以该模型为例介绍抗急性肝损伤药物对培养细胞的影响。
【材料】
1.雄性SD大鼠,体重250~300g。
2.试剂
(1)培养基(RPMI 1640)、胎牛血清等;
(2)消化液:胰蛋白酶、EDTA, N型胶原酶;
(3)缓冲液:Hanks液,D-Hanks液(每l000ml含NaCl 8.00g, KCl 0.40g, Na2HPO4·12H20 0.06g,NaHCO3 0.35g,KH2P04 0.06g) ,PBS(每l000ml含NaCl 8g, KC1 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2P04 0.24g)。
(4) 10%水合氯醛,MTT,超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒,二甲亚砜(DMSO)。
3.仪器 净化工作台、三气恒温孵箱、倒置显微镜、离心机、分光光度计、酶标仪、流式细胞仪。
【方法】
1.肝细胞缺氧培养以大鼠肝细胞两步灌流法分离原代肝细胞(及传代肝细胞)正常培养和缺氧培养为例的方法介绍如下。实验操作应完全在无菌条件下进行。细胞正常体外培养在5% C02与95%空气环境中,可通过降低培养环境的氧分压或使细胞用氧障碍造成缺氧。缺氧模型有物理性缺氧和化学性缺氧两种,用于制作低氧模型最理想的装置是三气培养箱。在此以物理缺氧的三气培养箱为例介绍肝细胞的缺氧培养。
(1)大鼠肝细胞的原代培养:制备体外原代肝细胞常用的方法有:非酶分离细胞法、离体肝脏酶消化分离法、在体肝脏酶灌注法等。这些分离方法可以相互补充,灵活应用。下面以在体肝脏酶灌注法为例制备原代肝细胞,按照Seglen的两步灌流法分离肝细胞制备肝细胞悬液:用10%水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠后将其固定在手术板上,常规消毒后打开腹腔,用静脉输液管行门静脉插管,灌入37℃的D-Hanks液(30m1/min ),同时剪断下腔静脉放血。灌流约5分钟后,待肝脏颜色完全变为土黄色后,改用37℃含0.05%Ⅳ型胶原酶的Hanks液继续灌流(10ml/min ),约15分钟后,压之凹陷不易恢复,迅速取下肝脏,剔除肝包膜,并不断抖动以抖落肝细胞,让细胞游离出来,200目滤网过滤。滤液600r/min离心2分钟,弃上清液,重复2次。将沉淀细胞悬浮于RPMI 1640培养液中接种于25 ml培养瓶,常规培养(37℃,5% C02,95% 02) 24~36小时后换入新鲜培养液。
(2)传代肝细胞的培养:因L02细胞在实验中较为常用,故以L02细胞为例介绍传代细胞的培养方法。L02为人正常肝细胞,生长在含1 mmol/L谷氨酰胺、1ug/ml葡萄糖0.22u/ml胰岛素和10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。
(3)肝细胞的缺氧/复氧培养:将肝细胞按1x106/ml分别接种于96孔和24孔培养板中,每组6孔,常规培养12小时。建立缺氧复氧的模型:缺氧培养(将细胞放入37℃,95% N2,5% C02培养箱中培养4小时),复氧培养(将细胞放入37℃,5% C02,95%空气培养箱中培养10小时)。
2.实验设计通常把细胞分成正常组、缺氧/复氧组(肝细胞进行缺氧4小时,复氧10小时处理)、若干给药组(缺氧/复氧,加不同剂量抗肝损伤药物)。给药组细胞在缺氧前两个小时给予不同剂量的药物处理。通过细胞形态学观察,MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡以及检测SOD的活性,从而研究抗急性肝损伤药物对缺氧复氧肝细胞的保护作用。
【结果与分析】
1.细胞形态观察正常生长的肝细胞呈三角形、方形或类圆形,排列整齐,细胞界限清晰,细胞质为颗粒状,丰富透亮。细胞核有单核、双核。部分细胞呈多边形展开,有些细胞开始呈岛状连接。损伤组如缺氧复氧(H/R)的肝细胞超微结构改变,细胞膜出现损伤,线粒体重度肿胀,内膜破裂,线粒体嵴明显减少或消失,出现气球样变,肝细胞的细胞核固缩,核内染色体消失。给药组的细胞,细胞膜及各种细胞器的膜结构比较完整,线粒体排列比较正常,无明显肿胀。
2. MTT法测定细胞存活率缺氧复氧结束后去掉96孔板中培养液,每孔加入5g/L的MTT液20ul,继续常规培养4小时,每孔加入DMSO 180ul,振荡后用酶标仪于波长570nm测定每孔的吸光度(OD)值,每组实验至少重复3次。
计算细胞存活率:
细胞存活率A值=(实验组OD值-空白对照OD值)/(正常组OD均值-空白对照OD值)x100%
3.细胞凋亡的检测缺氧复氧的条件下,肝细胞会发生明显的凋亡。
(1)细胞收集:从培养箱中取出复氧后的细胞,吸去培养液上清液,2m1 PBS清洗两遍。
(2)每瓶中加入含0.02% EDTA的0.25%胰酶0.5ml,37℃消化3分钟,倒置显微镜下见细胞变圆,细胞间隙变大时,加入2ml培养基终止消化。1000r/min离心5分钟,弃上清液。
(3)加入100ul 1倍的结合缓冲液(由20倍结合缓冲液制备),制备细胞悬液。
(4)向细胞悬液中加入10ul AnnexinV-FITC和5 u1碘化丙啶(PI),混合均匀。
(5)室温避光孵育15分钟(提示:在冰浴上操作将增加孵育时间,较高温度或较长时间的孵育将引起细胞的非特异性标记)。
(6)加入1倍结合缓冲液400 u1,充分混匀。
(7)流式细胞仪分析:流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm的通带滤器(band pass filter)检测FITC荧光,另一波长大于560nm的滤器检测PI。
4.肝细胞内SOD活性的检测收集24孔板的细胞,经1500r/min离心3分钟后,弃去上清液,将剩下的肝细胞加入细胞裂解液混匀,12 OOOr/min离心10分钟,取上清液按照SOD试剂盒的说明书测定肝细胞内SOD活性。随损伤加重,SOD活性下降。
【注意事项】
1.缺氧培养对氧气的含量要求严格,在实验造模的过程中,要严格控制氧含量,保证缺氧环境。
2.细胞在体外培养时其形态、性能和体内均有差别,因此,体外模型实验结果应结合活体实验结果进行客观分析,合理解释。
3.无菌操作是细胞培养成功的必备条件。细胞在培养的过程必须保证无微生物污染和不受其他有毒、有害因素的影响。
4.要找到最适灌流速度和压力,若灌流速度和压力不够,胶原酶无法充满整个肝脏导致消化不全;反之,流速太快、压力太大则会增加对肝细胞的机械性损伤,以上这两种情况均会导致分离的肝细胞活力的低下。
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