肝星形细胞（hepatic stellate cells,HSCs）增生、激活，并向肌成纤维样细胞转化的过程是肝纤维化产生的关键环节和核心事件，活化的肝星形细胞不断增殖，并合成大量的细胞外基质（extracellular matrix, ECM)，过量ECM沉积导致肝纤维化的发生。HSCs在肝纤维化的发生与发展中扮演着重要的角色，以HSCs为靶点的抗肝纤维化预防和治疗是一条重要和有效途径，主要包括抑制HSCs的活化和增生、诱导HSCs凋亡、刺激细胞产生基质蛋白酶类或下调其特异性抑制剂。

自1982年Knook等首次成功提取大鼠原代HSCs以来，迄今国内外专家学者已经成功采用不同的实验方法从大鼠肝脏中分离高纯度的HSCs。目前最常用的也是最经典的提取方法是原位酶灌注法，但往往由于Kuffer细胞的干扰较大，分离提取的HSCs纯度得不到保证，因此又出现了一系列的改良方法。

【原理和目的】

肝纤维化是一种由多因素引起的，具有多种病理表现，涉及多种病理机制的疾病。研究表明HSCs在炎症坏死的组织区域向肌成纤维细胞（myofibroblasts, MFB）转型的过程是肝纤维化的中心环节。活化的HSCs分泌大量的细胞外基质，促进肝血窦毛细血管化，抑制细胞外基质的分解，最终导致肝纤维化的发生。通常情况下，原代HSCs适用于静止HSCs的细胞生物学行为研究，而传代的HSCs适用于活化HSCs的细胞生物学行为研究。原代及传代的HSCs能够为肝纤维化研究提供良好的细胞实验模型，因此分离提取高纯度的HSCs就成为肝纤维化相关研究的关键一环，具有深远的意义。

【材料】

1．大鼠（雄性，体重400～500g)。

2．试剂

(1)培养液及消化液：DMEM培养基干粉、胎牛血清、链酶蛋白酶、胶原酶IV, DNA酶I；

(2）密度梯度离心介质：Nycordenz粉末；

(3）前灌流液（NaCl 9g, KC1 0.4g, Na₂HP0₄·12H₂0 0.151g,NaH₂P0₄·2H₂0 0.078g,Hepes 2.38g,EGTA 0.19g,酚磺酞0.006g,葡萄糖0.9g,NaHC03 0.35g、青霉素钾0.125g、硫酸链霉素0.1 g、加超纯水至终体积1000ml, pH≈7.3）；

(4)酶配制液（NaCl 8g,CaC1₂ 0.56g,KC1 0.4g,Hepes 2.38g,Na₂HP0₄·12H₂0 0.151g,NaHC0₃ 0.35g,酚磺酞0.006g、青霉素钾0.125g、链霉素0.1 g、加超纯水至终体积1000m1,pH≈7.3）；

(5）GBSS液（KCl 0.3g, CaCl₂ 0.17g, Na₂HP0₄·12H₂0 0.3g, MgC1₂·6H₂0 0.21g,NaHC0₃ 0.35 g,MgS0₄·7H₂0 0.07g,葡萄糖1.0g、加超纯水至终体积1000ml,pH≈7.3）；

（6）D-Hanks液（NaCl 8g, KCl 0.4g, KH₂P0₄ 0.06g, Na₂HPO₄·12H₂0 0.06g,酚磺酞0.02g,NaHCO₃ 0.35g、加超纯水至终体积1000ml,pH≈7.3）。

3.蠕动泵，C0₂培养箱，生物倒置显微镜，水浴锅，超净工作台，高速低温离心机，高温灭菌器。

【方法】

1．肝星形细胞的培养 以酶灌注法分离大鼠肝原代星形细胞及培养为例介绍如下。

(1)实验操作需要完全无菌，门脉插管经过高压灭菌，用75％乙醇浸泡10分钟，取出后用三蒸水涮洗浸泡。麻醉好的大鼠浸泡于已在37℃水浴中预热过的苯扎溴铵溶液中灭菌。结束后，轻轻弄掉大鼠身上的水，乙醚麻醉，乙醇消毒大鼠腹部。

(2) U形打开腹腔暴露肝脏，门静脉插管，开启蠕动泵，前灌流液37℃灌注，迅速剪断下腔静脉放血，灌注至肝脏变为土黄色，37℃链酶蛋白酶液和37℃胶原酶液循环灌注约20分钟，当包膜下肝脏组织变软并与肝包膜游离时，结束灌注。

(3）迅速剪下肝脏，放入培养皿中，剪碎肝组织，放入装有细胞分散液的三角烧瓶中，加入DNA酶I溶液。37℃恒温水浴振荡分散，20分钟。细胞悬液经纱布和200目筛网过滤入2个50m1离心管中，500r/min离心1分钟，弃沉淀；上清液1500r/min离心7分钟，弃上清液，加DNA酶I溶液，加D-Hanks溶液至40m1，充分吹打，1500r/min离心7分钟，弃上清液，重复2～3遍。弃上清液，加D-Hanks溶液制备细胞悬液。加33% Nycordenz溶液，混合悬浮细胞，在混合液上层小心地加一些D-Hanks溶液，1500r/min离心20分钟，界面处可见一白色细胞层，小心吸取至另一离心管中，加含20％胎牛血清的DMEM悬浮， 500r/min离心1分钟，弃沉淀，留上清液，即得肝星形细胞，计数。以10⁶/m1的浓度接种于培养瓶中，置37℃ ,湿度95% ,5% CO₂的孵箱中培养，48小时后将培养液换为含10％胎牛血清的DMEM培养液，自此每2～3天更换一次培养液。

2．实验设计原代细胞提取后，待其完全活化，消化制成细胞悬液，把细胞直接接种于96孔、24孔或6孔板中培养。待细胞贴壁后，即可实验。通常把细胞分为正常组（不加药）和给药组（加不同浓度药物）。给药组细胞给予含不同浓度药物的培养液，培养数小时（一般6～24小时），让药物与细胞充分作用，即可观察结果。另外，也可以将细胞用一些细胞因子（TGF-β1或PDGF )处理活化后，再把细胞分为正常组（不加药）和若干给药组（加不同浓度药物）。给药组细胞给予含不同浓度药物的培养液，培养数小时（一般6～24小时），让药物与细胞充分作用，即可观察结果。

【结果与分析】

1．大鼠肝原代星形细胞的形态观察新分离未贴壁的HSCs在倒置显微镜下呈圆形，胞质折光性强，体积明显小于肝细胞，但大于Kuffer细胞；24小时后大部分细胞贴壁，呈扁圆形、椭圆形，一部分细胞开始伸展；48小时后大部分细胞伸展生长，一部分细胞出现多角伪足；7天后细胞开始呈现典型的星状外形，体积增大，呈局灶性生长；14天后细胞完全活化，呈现典型的成纤维细胞样形态（图11-17)。

2．细胞活率鉴定方法锥虫蓝拒染实验：细胞悬液与0.4％的锥虫蓝溶液以1:1的比例混匀，计数。

3. TUNEL染色将活化的细胞制成细胞悬液，把细胞直接接种于6孔板中培养，待细胞贴壁后，给予不同浓度药物培养数小时（一般6～24小时），让药物与细胞充分作用，然后弃去上清液，并用Hanks液轻轻冲洗几次，用4％多聚甲醛固定，然后按照TUNEL试剂盒说明书操作，用激光共聚焦显微镜观察染色结果。

4. a-SMA含量检测一种方法：将活化的细胞制成细胞悬液，把细胞直接接种于6孔板中培养，待细胞贴壁后，给予不同浓度药物培养数小时（一般6～24小时），让药物与细胞充分作用，然后弃去上清液，并用Hanks液轻轻冲洗几次，提取细胞蛋白，测定蛋白浓度。细胞蛋白经10％聚丙烯酰胺凝胶分离，转膜，经5％脱脂牛奶封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育3小时，ECL显色，照相，分析条带光密度值，查看a-SMA的表达情况。另一种方法：将活化的细胞制成细胞悬液，把细胞直接接种于6孔板中培养，待细胞贴壁后，给予不同浓度药物培养数小时（一般6～24小时），让药物与细胞充分作用，然后弃去上清液，并用Hanks液轻轻冲洗几次，4％多聚甲醛固定，PBS清洗，0.2% TnitonX-100溶液打孔，PBS清洗，2％脱脂牛奶37℃孵育1小时，PBS清洗，一抗（用2％脱脂牛奶配制）37℃孵育2小时，PBS清洗，FITC标记的二抗37℃孵育1小时，PBS清洗，加入1ug/ ml的DAPI溶液，37℃孵育7分钟，PBS清洗，用荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察。a-SMA的表达情况。

【注意事项】

1．肝星形细胞的鉴别采用desmin和GFAP免疫细胞化学共同鉴定：在接种细胞前，将用多聚赖氨酸包被的无菌盖玻片放入六孔板中，细胞以106/ml的浓度接种于孔内，24小时后取出盖玻片，丙酮4℃固定15小时，风干，进行desmin和GFAP免疫细胞化学双抗单染色法。

2．肝脏中HSCs与其他非实质细胞浮力差异是密度梯度离心分离的基础。HSCs难以分离，主要是由于其比重范围与库普弗细胞交叠，并且容易与肝细胞吸附在一起。

3．体重超过500g的老年大鼠和100g左右的幼年大鼠肝脏中HSCs含有较多的维生素A脂质，根据其低密度的性质，在细胞分离及纯化过程中可以获得更多数量的细胞，因此在选择动物是尽量选择老年或幼年大鼠。

4．肝脏酶灌流前，血液要冲洗干净。

5．链霉蛋白酶的消化需适当，消化不充分，将存在大量肝细胞，影响HSCs的纯度，消化过度则损伤细胞。

6．用来分离、纯化HSCs的介质种类有很多，Metrizamide较可靠，但价格较高，Stractan价格虽低，但配制复杂，Nycordenz与Metrizamide分离效果相同，但价格较便宜，因此选用Nycordenz比较恰当。

7．无菌操作是细胞培养成功的必备条件，培养液中小牛血清质量是细胞生长良好与否的重要因素，pH必须保持在7.2～7.4之间。

8．试剂与细胞孵育时间保护性药品与细胞孵育时间应根据药品性质决定。