肝脏有极强的再生功能。肝脏切除（hepatectomy) 2/3后，10～14天残余的肝脏就可恢复到原来的大小。这说明肝再生程度不仅快，而且强。因此肝部分切除动物模型往往被用来研究肝再生机制及促进肝再生药物的开发。但是肝部分切除动物模型的制作比较复杂，需要的技术程度也比较高，需要动物的数量也较多，耗资较大，因此不适合促进肝再生药物的高通量筛选。而原代培养动物肝细胞的肝再生实验模型则可替代肝部分切除动物模型，用于肝再生药物的高通量筛选。原代培养动物肝细胞的肝再生实验的优点是操作简单、易于掌握、需要周期短；缺点是肝细胞不能继代培养，每次实验必须当日取细胞后立即做实验。

［原理和目的］

肝再生时肝细胞核DNA合成增加，DNA合成时需要DNA合成的原料。反映肝细胞增生程度的labeling index法实验中所采用的DNA合成原料为脱氧尿苷( deoxyuridine )。肝细胞再生时肝细胞摄取DNA合成原料增加，因此测定肝细胞中被摄取的脱氧尿苷量即可知道肝细胞再生的程度。在原代培养大鼠肝细胞的肝再生实验中，一般选用碘-125放射性标记的125I-脱氧尿苷。通过放射性测定，125I-脱氧尿苷的含量而了解肝细胞再生的程度。

【材料】

1．实验选用体重150～200g的大鼠，因为周龄较小的大鼠肝再生活跃；

2．胶原酶、小牛血清、胰岛素、地塞米松、卡那霉素；

3.125I-脱氧尿苷,cold I-脱氧尿苷；

4. 24孔培养板、WE培养基；

5．肝灌流装置。

【方法】

肝细胞的分离、培养及125I-脱氧尿苷的测定

根据刘克辛等介绍的方法，采用在体大鼠胶原酶肝灌流的方法分离肝细胞。简言之，动物乙醚麻醉，游离门静脉插管作为灌流液入口，下腔静脉（右心耳处）插管作为灌流液出口（图11-14)。预灌流液为WE培养基，0.5分钟后灌注0.05％胶原酶。待肝脏消化后剪去肝被膜，将肝脏剪碎，纱布过滤，将肝细胞悬液离心（600r/min,5分钟），取沉淀的肝实质细胞，加入含10％小牛血清的WE培养基（含10-9M胰岛素，10-9M地塞米松，30mg/L卡那霉素），细胞浓度为2.5x10⁵/ml，每孔0.5 ml铺24孔培养板，放入5% C0₂孵箱内孵育。3小时后以同样含小牛血清的WE培养基换液，24小时后换不含小牛血清的WE培养基（也不含胰岛素，地塞米松和卡那霉素）。此时加入促进肝再生药物，放入5% C0₂孵箱内孵育。22小时后加入125I-脱氧尿苷。125I-脱氧尿苷配制如下：

125I-脱氧尿苷 1 mCi/2m12m1

PBS(+0.25% BSA)64m1

5 mM cold I-脱氧尿苷 0.32m1

在24孔(500ul的培养基）中添加10ul 125I-脱氧尿苷配制液（最终培养基中cold I-脱氧尿苷为0.48 uM, hot125I-脱氧尿苷为0.3uCi/ml,0.14nM)。加入125I-脱氧尿苷6小时后，按下述方法操作：

1．弃掉反应液（含125I-脱氧尿苷），加入1ml PBS(室温下放置的即可）。

2．弃掉PBS，再加1ml PBS，弃掉PBS。

3．加入500ul室温下放置的10％的三氯醋酸（TCA)目的是在细胞膜开孔，使游离的125I-脱氧尿苷通过孔流出。但是，DNA合成时摄取的125I-脱氧尿苷和蛋白质被TCA沉淀），放置5分钟。

4．在well底出现白色的TCA沉淀的一层，弃掉上清液。

5．加入500ul 2N Na0H,60℃孵育30分钟溶解，用显微镜确认溶解的情况。

6．用移液管反复吸取至待测管中，用g测定仪进行放射性粒子数测定。

【结巢与分析】

肝细胞培养2小时前，细胞尚不融合，细胞呈圆形，较小。培养24小时以上时细胞明显发生融合，肝细胞呈多角状，细胞核清晰，核仁可见（图11-15）。以促进肝再生活性的肝细胞生长因子（hepatocytegrowth factor, HGF）为例，20pM的HGF即可促进肝细胞增殖，120pM达到最大值（图11-16)。

【注意事项】

1．肝细胞再生实验中，肝细胞的密度不能过大，否则影响再生。

2．分离肝细胞时一定要动作轻柔，否则会损害肝细胞。成活肝细胞的比例应该在80%以上。

3．不要取高龄大鼠，否则肝再生效果不佳。

4．肝灌流时，肝的颜色要均一变黄，否则分离不佳。