体外细胞培养理论和相关技术的完善和成熟，极大加速了当代药物研发的进程，从药物早期设计、筛选到药理活性、机制研究，都离不开体外细胞实验。其中，考察药物对培养细胞增殖影响的实验，是药物开发过程中最基础、应用最广泛的实验方法，其实验结果直接决定了药物的下一步研发方向。目前，实验室常用MTT法和有丝分裂指数法考察药物对培养细胞增殖的影响，方法简便易行，可用于大规模的药物筛选实验，广泛应用于药物研发特别是抗肿瘤药物的研发过程中。值得注意的是，两者都基于药物孵育后活细胞的相对数量以反映药物对培养细胞增殖的影响，只能用来检测细胞相对数和相对活力，而无法考察凋亡细胞的数量，在实验设计过程中应该注意。

一、MTT法

［原理和目的］

MIT法是一种检测细胞存活和生长的方法，是药理学实验中常用的考察药物对培养细胞增殖影响的实验方法，基于活细胞对MTT生物转化产物的吸光度，采用比色法反映活细胞数量。因为灵敏度高、检测方法简单、经济、快速，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

MTT化学名为3-(4,5一二甲基噻唑）-3,5-二苯基四氮唑溴盐［3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide]，商品名为噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲攒( formazan )，并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能，由此区分细胞活性。在一定细胞数范围内，形成的甲攒量与活细胞数成正比。细胞中的甲臜能溶解在二甲亚砜( dimethyl sulfoxide,DMSO）等有机溶剂中，通过测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

【材料】

1．状态良好的人结肠癌细胞系Caco-2（贴壁细胞）和人白血病细胞系K562悬浮细胞）。

2．试剂胰蛋白酶、小牛血清、培养基（DMEM或RPMI 1640培养粉）、双抗。MTT干粉、DMSO,SDS、异丁醇、浓盐酸、D-Hanks液（每1000m1含NaCl 8.00g, KC1 0.40g, NaH₂P0₄.H₂0 0.06g,NaHC0₃ 0.35 g)、PBS液（每l000ml含NaCl 8g, KCl 0.2g, Na₂HP0₄·12H₂0 2.86g，KH₂P0₄0.2g) ,75％乙醇。

3．仪器净化工作台、C0₂孵箱、倒置显微镜、细胞计数板、0.22um微孔滤膜滤器、铝箔、96孔板、平板离心机、酶标仪。

【方法】

1. MTT溶液的配制 MTT具有致癌性，操作时须戴手套。整个过程应避光操作，容器用铝箔包裹或使用不透明及褐色容器。称取MTT干粉50mg，溶于10m1 PBS或生理盐水中，60℃水浴或超声助溶，终浓度为5 mg/ml。完全溶解后，使用0.22um微孔滤膜滤器过滤除菌，1.5m1 EP管分装，-20℃避光冻存待用。可长时间保存，避免反复冻融，当MTT溶液变为灰绿色时不能再用。

2．甲臜溶解液的准备 DMSO能够溶解甲臜，无需配制，使用方便，溶解速度快，适用于贴壁细胞。但对人体毒性较大，且需吸除原培养液，在此过程中，可能会损失部分甲臜结晶，导致结果不稳定。

使用三联液（SDS-异丁醇-盐酸）溶解甲攒，可直接加入原培养液中，贴壁细胞和悬浮细胞都能使用。但是，需要提前配制，且溶解速度慢。三联液的配制：称取SDS 10g，异丁醇5ml,10M HCl 0.lml，用双蒸水溶解配成100m1溶液，搅拌均匀后高压灭菌2小时，常温放置。

3．铺板对贴壁细胞，例如Caco-2细胞，选择状态良好、汇合度达80％左右的细胞单层，弃去培养液，使用D-Hanks液轻柔的清洗三次以除去表面杂物，胰酶消化后，新鲜培养液吹打均匀。对悬浮细胞，例如K562细胞，选择对数期细胞悬液，500～1000r/min离心5分钟，弃去培养液，新鲜培养液吹打均匀。

取制备的细胞悬液，锥虫蓝染色计数，调整细胞悬液浓度为10⁴～10⁵/ml。取96孔板，每孔加入100ul细胞悬液。对于生长迅速的癌细胞，接种密度为4000/孔即可。96孔板边缘的36个孔，由于培养时孔内水分蒸发明显，不建议使用；同时，向孔内加入无菌的PBS可减少板内部各孔的水分挥发。此外，应预留调零孔，加入不含细胞的培养液100ul。

铺板完成后，置37℃,5% CO2的孵箱中培养过夜，使细胞贴壁。对于悬浮细胞，铺板后可直接进行下一步。

4．加药使用不含血清的培养液配制梯度浓度的试药溶液，首次实验时，浓度区间应尽可能大或参考文献。取出96孔板，加入不同浓度的药液20ul，每个浓度设3～6个复孔。对照孔加入不含血清的培养液20ul。然后置于37℃ ,5% CO₂的孵箱中继续培养，按照各种细胞自身的生长属性，设置不同的培养时间，一般培养24～72小时。时间太短，药物的影响不容易发现；时间太长，孔内培养液营养不足，会导致细胞“饥饿”而停止生长。

5．加入MTT溶液在设定时间取出96孔板，每孔加入MTT溶液10ul，振荡器混匀后继续培养4小时。如果药物和MTT能够发生反应，则须弃去含药培养液，换新鲜培养液后方可加入MTT溶液。

6．甲攒的溶解和测定加入MTT溶液后4小时，加入甲臜溶解液终止反应。使用DMSO溶解甲臜时，需要弃去含有MTT的培养液。对于贴壁细胞如Caco-2细胞，倾斜96孔板，用移液器小心吸取上清液或者直接倾倒96孔板，并用滤纸吸干废液；对于悬浮细胞如K562细胞，使用平板离心机离心96孔板，2000r/min离心10分钟，吸掉上清液。然后，每孔加入150ul DMSO，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。立即使用酶标仪测量490nm处各孔的吸光值。

使用三联液溶解甲臜时，不需弃去废液，直接向孔内加入100ul三联液，置摇床上低速振荡均匀后继续培养过夜。次日用酶标仪测量570nm处各孔的吸光值。

【结果与分析】

测定各孔吸光度值时，需要扣除调零孔的吸光度值或直接设定调零孔的吸光度值为0。

若是药物抑制实验，则须计算抑制率和半数抑制浓度（IC50)。计算公式如下。

抑制率=（加药组OD-对照组OD)／对照组OD;

1gIC₅₀=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)；其中，Xm=1g（最大剂量）,I=1g（最大剂量／相临剂量）,P=阳性反应率之和（即各浓度药物组抑制率之和）,Pm=最大阳性反应率，Pn=最小阳性反应率。该公式只能近似的计算IC₅₀，现在有许多专业的数据作图软件，如GraphPad Prism, SPSS等，可以通过作图，更准确的拟合得到IC₅₀。

【注意事项】

1. MTT溶液的配制和保存 MTT溶液最好现用现配，过滤后避光保存两周内有效，冻存在-20℃可长期保存，但应避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。MTT溶液对细菌很敏感，需要无菌保存。

2．接种密度和培养时间 MTT法基于比色法反映细胞的活性和数量，因此，要符合朗伯-比尔定律的要求，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈线性关系。在进行MTT试验前，要进行预实验检测接种细胞的贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以防止细胞过满。肿瘤细胞增殖迅速，接种密度不宜过大，4000～5000/孔即可；培养时间一般为24小时或48小时，最多不超过72小时。各孔的吸光度值，要控制在0.2～0.8之间，此时误差较小。

3．铺板铺板时，细胞悬液要吹打均匀，接种几个孔后要重新吹打细胞悬液以防细胞下沉，保证96孔板中细胞密度的均一。此外，高浓度的血清物质会影响试验孔的光吸收值，一般选小于10％胎牛血清的培养液悬浮细胞。

4．无菌MTT溶液对细菌很敏感，细菌也能转化MTT，使吸光度值升高，干扰实验结果。如加入MTT后有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性较大。在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的常常是邻近的孔。