HLA抗原细胞学分型方法常用混合淋巴细胞培养（MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR)。

［原理］

两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于 HLA Ⅱ类抗原中D和DP抗原（淋巴细胞鉴定的抗原，SD抗原）不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养（two way MLC)；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C (mytomycine C)处理或经射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养（one way MLC)。两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或，H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞（homozygous typing cell, HTC )作为刺激细胞，则可检测待检者的D位点抗原型别。若待检者抗原与标准HLA-D抗原相同，MLC不发生增殖，此为HLA-D抗原阴性分型法。EB病毒转化的B淋巴母细胞表达高水平的HLA Ⅱ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。

【材料】

1. C57BL(H-2b）和Balb/C (H-2d）小鼠脾脏制备细胞悬液；

2．丝裂霉素C;

3. 5% NBS培养液；

4. 96孔培养板；

5. C0₂孵箱；

6. ³H-TdR 。

【方法】

（传统的标准方法）

1．取C57BL(H-2b）和Balb/C (H-2d）小鼠脾脏制备细胞悬液。

2. Balb/C小FR脾细胞悬液（2x10⁷/ml）加丝裂霉素C(50 ug/ml）于37℃，处理30分钟。

3．培养液洗涤3次后用5% NBS培养液配制细胞悬液（5x10⁶/ml)，作为刺激细胞，加入96孔培养板，5x10⁵/100微升·孔。

4．加入C57BL脾细胞悬液，为反应细胞，也是5x10⁵/100微升·孔；另设单独刺激细胞孔和单独反应细胞孔，均为3个复孔。

5．置37℃,5% CO₂孵箱中培养5天。

6．加3H-TdR 0.5微居里／孔，再置37℃,5% CO₂孵箱中培养12～16小时后，收集细胞于玻璃纤维滤纸上。

7．干燥后用液闪法测定cpm值，根据以下公式计算刺激指数（SI)：

SI=（混合反应细胞孔cpm-刺激细胞孔cpm值）／反应细胞孔epm值

【结果】

Balb/C小鼠6～8周龄脾细胞对C57BL小鼠脾细胞的MLR的SI为：13.5，出生后0～2天去胸腺的Balb/C小鼠，6-8周龄的脾细胞的MLR的SI; 3.0

【注意事项】

1．注意无菌操作。

2．刺激细胞接受照射剂量要准确，使细胞暂时存活，但失去增殖的能力。

3．可用Raji或Daudi细胞作为刺激细胞，也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。

日LA DNA分型技术

是指应用分子生物学技术进行HLA的分型，一类是PCR为基础的基因分型，一类是以测序为基础的基因分型。常有PCR-SSO ( sequence specific oligonucleotide，序列特异的寡核苷酸）,PCR-SSP( sequence specific primer，序列特异引物）、PCR-SBT( Sequence based typing，测序分型）等，这里不作介绍。