恶性黑素瘤最常见于皮肤，但有10％出现在眼部。临床上根据肿瘤浸润的深度诊断分期，一般取材为人皮肤组织。研究表明，要在体外培养黑素瘤细胞，需要在培养基内添加不同的生长因子。

【材料】

1．取材自黑色素瘤部位的皮肤组织。

2．基础培养基 Ham's F10 (10％胎牛血清、5g/ml胰岛素、6mmol/L谷氨酰胺、5ng/ml表皮生长因子、lOng/ml TPA)。

3．生长因子 bFGF（重组人源型，碱性成纤维细胞生长因子，10 ug/ml )、肝素（1ug/ml)、 ET-1(人或猪来源的内皮素-1, 10umol/L储存液）、HGF/SF（人源，肝细胞生长因子／分散因子，40 ug/ml),SCF/M（干细胞因子／肥大细胞因子，100ug/ml)。

4. D-Hanks液、PBS,O.25％胰蛋白酶、中性蛋白酶(25.4mg/ml )、胶原酶(200U/ml)。

5．眼科剪刀、眼科镊子、手术刀、玻璃平皿、培养瓶、玻璃吸管、离心管。

【方法】

1．将取材的皮肤组织放入1Ocm的玻璃平皿中，用10m1 70％的乙醇浸泡30分钟后，移入新的平皿中，用D-Hanks液冲洗，剪去皮下脂肪组织。

2．用手术刀切成0.5cm²的小片，放入含有中性蛋白酶的平皿中，用镊子牵拉皮肤，使其铺平，均匀浸入中性蛋白酶液面下，4℃消化18～24小时。

3．弃去消化液，在D-Hanks液中分离表皮和真皮。当表皮层与真皮层分离时，表皮层为浅棕色，真皮层为白色，用镊子将表皮剥脱，放入离心管中。真皮层弃掉。

4．加入0.25%胰蛋白酶,37℃消化15分钟。用玻璃吸管吹散细胞。

5．用离心机1000r/min，离心5分钟，沉淀细胞。

6．仔细吸走上清，用D-Hanks液离心洗涤1次后，加入新鲜培养液重悬细胞，接种于培养瓶中。

【结果】

接种后的细胞每3天换液一次，细胞铺满后，用胰蛋白酶消化后，进行传代。

【注意事项】

1．由于是皮肤组织的培养，所以要注意培养前对组织进行消毒，防止后期培养过程中出现污染。

2．消化过程应达到使表皮层与真皮层分离即可。消化液的量和消化时间视皮肤的厚度与大小而定。

3．如果取材是来源于痣及原发黑素瘤细胞培养，则不扔掉真皮，因为很大部分黑素细胞可能位于真皮层内，将分离的真皮层分别消化后，收集黑素细胞培养。

4．来源于晚期病变的黑素瘤细胞培养，将手术取材后的组织先用镊子挤压组织，恶性肿瘤细胞常会涌出。接着，将整个组织直接用胶原酶消化分离即可。