卵巢癌虽然不是最常见的妇科癌症，但是它的死亡率却是最高的，据统计，各国的卵巢癌发病率在1/1000000～17/1000000不等。20世纪60年代，人们就开始努力研究体外培养卵巢肿瘤细胞的方法，并同时将抗癌药物引入临床使用。卵巢腺癌派生的连续细胞系首次报道于20世纪70年代，并详细描述了卵巢肿瘤细胞的培养特征。

在不同实验室，虽然得到原代培养的肿瘤比例较高，但用临床样本建立卵巢肿瘤细胞系的成功率却只有1％～30%。失败的原因通常是上皮细胞增殖缺乏，或伴有间质细胞的过度增殖。本文主要从细胞分离方法入手，着重介绍实体卵巢肿瘤的原代培养方法。

（一）卵巢癌细胞的分离

【材料】

（1）卵巢癌实体组织、无菌D-Hanks液。

(2）培养基（DMEM）包含：NaHC0₃ 3.7g/L、胰岛素201U/ml,链霉素100 ug/ml、青霉素l00IU/ml、丙酮酸钠1 mmol/L、谷氨酰胺2 mmol/L,10％胎牛血清。

(3) 0.25％的胰蛋白酶或含EDTA（可在GIBCO公司购买成品）,0.4% DNase I。

(4）眼科剪刀、眼科镊子、手术刀片、玻璃培养皿、培养瓶、玻璃吸管、离心管，37℃恒温水浴摇床。

【方法】

1．机械分离法

(1)将肿瘤组织从运输容器中转移到玻璃培养皿中。记录组织的大小和外观。剔除脂肪、被膜和坏死组织（通常是脆性和带血的，可能含有脓液灶）。肿瘤可能是实体的或含有囊性成分，在这种情况下从囊肿壁向内或向外突出的实体区域应该被选择用于破碎。

(2)用10ml无菌D-Hanks液（假定样品材料直径约为2cm）洗涤组织的外表面以除去血液，弃洗涤液。洗涤3遍。

(3）如果肿瘤比较柔软，采用眼科剪刀剪碎；如果肿瘤比较坚硬，则手术刀结合镊子固定组织的方法，将组织剁碎成直径为3～5mm小块。如果不方便完成所有破碎程序，组织块可以在培养基（培养基与组织的体积比约为10:1)中4℃保存过夜。次日继续分离组织细胞。

(4）玻璃培养皿中加入l0ml无菌D-Hanks液，搅拌组织块以除去所有血液（其中含有胰蛋白酶抑制剂）。

(5)将玻璃培养皿倾斜成水平方向10^o～20^o，使组织块浸入培养皿的倾斜角液面下。

(6）用吸管轻吸含有血液和松散的肿瘤细胞的洗涤液，将之移入离心管中。再将该洗涤程序重复2次。收集洗涤液并在1500r/min离心5分钟。

(7）在l0ml培养基中重悬细胞沉淀，标上“洗涤液”并保存于4℃。

(8)用眼科剪刀将残余的肿瘤块轻轻剪碎成小块（直径2～4mm)，同时用适量的D-Hanks液保持组织的湿润。将剪切好的组织用吸管移入离心管中，待进行后续操作。

2．胰蛋白酶消化分离法

(1）取10ml 0.25％的胰蛋白酶或含EDTA，加入100u1 0.4% DNase I使终浓度达到0.004%。目标是两体积0.25%胰蛋白酶/DNase I溶液对一体积组织块。（破碎溶液中添加DNase I的理由是，从胰酶消化后破裂的细胞中释放出变性DNA，使组织块变得特别黏，粘在活细胞上引起再聚集，这使得回收细胞很困难）。

(2)在机械分离法中得到的肿瘤组织碎块中，加入胰蛋白酶溶液，4℃培养过夜。

(3）次日，将切碎的肿瘤组织转移到无菌广口锥形瓶中。

(4）每2cm³肿瘤组织加入20～30m1温浴的0.25%胰蛋白酶／0.004% DNase I溶液中，轻轻摇动锥形瓶使其混匀。

(5）采用振摇式37℃水浴，并选择合适的速度，使组织处于连续悬浮状态但不产生泡沫为宜。如果搅拌太剧烈，将引起细胞的机械性损伤。

(6) 15～20分钟后，取下瓶子，使组织块因重力沉降。

(7）轻轻地倒出或吸出含有胰蛋白酶溶液的分离细胞，移入50ml离心管中。

(8)向瓶中剩余的肿瘤组织碎块加入30ml新鲜的胰蛋白酶/DNase I溶液，重复步骤(4)～(7）。

(9)每次在含有胰蛋白酶溶液的分离细胞液中，应及时加入等体积含有10％胎牛血清的培养基。因步骤（7）中的收集液中含有胰蛋白酶溶液，胎牛血清可以使胰蛋白酶失去活性，保护细胞免受过度的酶解消化。

(10）终止消化的细胞悬液，在1500r/min离心5分钟，用新鲜培养基重悬细胞后，进行后续实验操作或保存于4℃。

【结果】

重复步骤（4)～（7）直至肿瘤块被完全分解，仅仅剩下漂浮的白色结缔组织碎片。最好按顺序标上序号。如果组织事先在冷胰蛋白酶中消化过夜的话，通常经过两次胰蛋白酶消化之后分解就比较完全了。如果组织仅用温热胰蛋白酶消化的话，可能需要更多次。每一次胰蛋白酶消化的时间都需要根据组织的密度进行调整，例如很柔软的组织小于20分钟，坚硬的组织大于30分钟。进行后续实验时，从冰箱中取出每一个每次标号的细胞悬液，应用血细胞计数器和活细胞染色（如锥虫蓝），检测每一组的细胞数和细胞活力。

（二）去除红细胞

经上述方法得到的细胞悬液中，可能含有大量的红细胞。在没有红细胞的情况下，细胞黏附会大大提高，有几种可选的去除红细胞的有效方法。①渗透压脉冲（快速吹吸裂解），在无菌水中进行，后加双倍强度的培养基以恢复正常渗透压；②用Lympho Sep或相似的密度介质进行密度梯度离心；③用购买的红细胞裂解试剂进行裂解。密度梯度离心的优势在于可以去除连同血红细胞一起的死细胞，从而提高细胞悬液的活力。因此本文主要介绍此种方法，以去除细胞悬液中的红细胞。

【材料】

1．密度介质：Ficoll/Hypaque,Lymphosep , Histopaque、或密度为1.077g/ml的同等介质。

2．玻璃吸管、离心管、移液器。

【方法】

1．按照I ml细胞沉淀约l0ml培养基的比例，用培养基重悬细胞沉淀。

2．将15 ml密度介质加入离心管中。小心缓慢地将重悬的细胞铺于密度介质上，避免快速或吹吸搅动界面。该步骤在两层之间最小程度地搅动可以得到最佳的分离效果。

3．在离心机上采用1500r/min离心20分钟。

4．从离心机中小心的取出离心管。这时管底是含有血红细胞／死细胞的沉淀，其上是一个清亮的密度介质层，以及在两种介质的交界处形成的凹液面细胞层，细胞层上方是清亮培养基层。用移液器小心地将交界处的细胞转移到新的离心管中。

5．用20ml培养基混合回收的细胞悬液以洗掉密度介质。

6．以1500r/min，离心5分钟，并重复洗涤步骤。

7．用5～l0ml培养基重悬得到的细胞沉淀，此为最终待培养的细胞悬液。

（三）卵巢癌细胞的原代培养

1．实体肿瘤组织的原代培养

【材料】

分离后的肿瘤细胞悬液、培养基（参考前文所述）、培养皿、离心管。

【方法】

(1)用血细胞计数板和活细胞染色（如锥虫蓝法）对细胞悬液中的活细胞进行大致计数。

(2）调整最终细胞浓度为每毫升培养基约2x10⁵个，并接种于细胞培养皿中。

(3)将培养皿放置于37℃培养60分钟，进行差速贴壁，使细胞悬液中的间质细胞黏附贴壁。

(4）将差速贴壁后的细胞悬液移入新的培养皿中，以5x10⁵/ml细胞数量接种培养。

【结果】

通常从卵巢肿瘤中会衍生出间皮细胞。在倒置相差显微镜下检查瓶中的扁平间皮细胞，将上皮凝块吹起。培养时间需要根据不同肿瘤衍生出的细胞群体的不同作出调整。以找到准确的时间是反复试验的结果。

2．腹水来源的肿瘤细胞的原代培养

【材料】

含卵巢肿瘤细胞的腹水、肝素100/ml、培养基（详见前文所述）、离心管等。

【方法】

(1)如果腹水在超过8分钟后处理，可以使用100U/ml的肝素以防止凝集。

(2）将腹水转移至无菌离心管中，3000r/min，离心15分钟。弃上清液。

(3）将沉淀重悬于5m1培养基中，收集细胞悬液，保存于4℃。

(4)在上述过程任一步骤后，加人去除血红细胞的步骤（具体方法见前文所述）。

(5)为减少间质细胞污染，应进行上述实验步骤中差速贴壁的步骤后，降低成纤维细胞的混杂。

(6）最终对细胞悬液进行计数，并以2x10⁵/ml的细胞密度重悬于培养液中进行接种。

【结果】

原代培养开始后，4～7天可形成单层细胞，细胞可能包括以下几种情况：①非贴壁肿瘤细胞：这类细胞可能来自腹水。这些细胞在悬液中即使放置1周或更久也不增殖或贴壁。在更换培养液时像悬浮培养一样处理细胞，先将细胞离心，弃去原培养基后，加入新鲜培养基，重悬后继续培养。②贴壁细胞：这种情况为理想的细胞类型。③混杂有间质细胞的贴壁细胞群体：这类细胞是最常见的，在传代过程中，为了降低间质细胞的污染，一般都会采取差速贴壁的方法，多次传代后，有可能去除大部分的间质细胞。