（一）肿瘤细胞的原代培养

肿瘤细胞的培养方法很多，主要有组织块培养法、酶消化法、钮网法、改良器官培养法等。对实体瘤而言，目前最常用的方法是组织块培养法和酶消化法。

1．组织块培养法是一种简便易行且成功率较高的常用原代培养方法。即将组织剪切成小块后，接种于培养瓶。培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理。例如预先铺被胶原或多聚赖氨酸，以利于贴壁细胞的生长。组织块法操作简便，部分种类的组织细胞在小块贴壁培养24小时后，细胞就从组织块向四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。组织块法特别适合于组织量少的原代肿瘤培养。以下对此方法做简单介绍，针对不同肿瘤细胞的具体培养方法请参考相关章节。

【材料】

（1)组织来源：实体瘤组织。

(2）培养液（具体配制方法根据不同肿瘤细胞请参考相关章节）。

(3)器具：培养瓶、弯头玻璃吸管和胶帽、小烧杯、眼科剪、眼科镊子、牙科探针等。

【方法】

(1)按照前述的实体瘤取材基本原则和方法取材、修剪，将组织剪或切成1 mm³左右的小块。在剪切过程中，可以适当向组织上滴加1～2滴培养液，以保持组织块湿润。

(2）将剪切好的组织小块，用眼科镊子送入培养瓶内。用牙科探针或弯头玻璃吸管将组织块在瓶壁上均匀摆置，每小块间距5mm左右。组织块的量不要过多，如50ml培养瓶，放置20～30个组织小块为宜。组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在37℃培养箱内。

(3）放置2～4小时，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。此过程动作要轻巧，让液体缓缓覆盖组织小块。动作过快液体产生冲力可使贴附的组织块漂起而造成原代培养失败。若组织块不易贴壁可预先在瓶底铺被胶原或多聚赖氨酸等（图7-1)。

【结果】

组织块接种后1～3天，可见组织块周围有部分游离出的细胞贴壁生长。原代培养3～5天，需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞，待贴壁细胞覆盖培养瓶达80％以上，即可传代。

2.酶消化培养法这种方法采用前述的组织消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质，包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，或者将已剪切成较小体积的组织进一步制备成细胞悬液，进行培养的方法。通过酶消化法分离的细胞，数量较多、容易生长、成活率高。常用的消化酶主要是胰蛋白酶和胶原酶。以胰蛋白酶为例方法如下：

【材料】

(1)组织来源：取材后的实体瘤组织。

(2)培养用液：0.25％胰蛋白酶、含血清的培养液。

(1）取材修剪冲洗；(2）剪切成lmm³小块；(3）移入培养瓶；(4）分布组织小块间距5 mm; (5）翻转培养瓶并加适量培养液，37℃静置2～4小时；(6)翻正培养瓶进行培养；(7)原代细胞生长。

(3)器具：烧杯、离心管、不锈钢筛网、玻璃吸管、培养皿、眼科剪、细胞计数板等。

【方法】

(1)将取材后的组织加少量培养液后剪碎成糜状，将剪碎后的组织移入离心管，加入适量0.25％胰蛋白酶消化，消化过程中随时观察组织分散状态，如发现大部分组织已分散成细胞团或单个细胞，则加入含血清的培养基终止消化。

(2）将终止消化后的液体经不锈钢筛网过滤，将未分散的组织团块和纤维组织去除掉。

(3）过滤后的消化液以800～1000r/min低速离心5分钟，去除上清液，加入新鲜培养液后，用玻璃吸管轻轻吹打制成细胞悬液。细胞计数后，以一定密度接种到培养皿中，置37℃,5% C0₂孵箱中培养。

【结果】

培养24小时后，镜下观察细胞开始贴壁生长，可更换新鲜培养液；此后每3天换液1次，待贴壁细胞覆盖培养皿底达80％以上，即可传代。

【原代肿瘤细胞培养注意事项】

1．培养材料应取自癌细胞集中、细胞活力较好的部分，取材后应立即培养。

2．培养期间应特别注意无菌操作，避免污染。一旦发现，应及时清除，以防止给培养箱及其他细胞带来污染。

3．组织块接种后的1～3天，组织块的贴壁不牢固，在观察和移动过程中要注意动作轻柔，尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块的冲击力使其漂起。

4．在原代培养中，常见有成纤维细胞混杂生长。由于成纤维细胞增殖迅速，经常阻碍癌细胞生长，故应及时清除。

5．采用酶消化分离细胞时，应注意时间不要过长，否则会影响成活率。消化过程中应适当摇动离心管，以保证组织团块充分接触消化酶。

6．原发癌组织和转移淋巴结一样，有时发生淋巴母细胞样增殖。遇到这种情况应用等密度离心法清除这些细胞，否则癌细胞会被杀死。

7．如果实验室同时保存或使用多种其他细胞株，应避免细胞株之间的污染。