一、肿瘤细胞的取材方法

人癌细胞培养所用的材料一般取自患者，主要来源于外科手术或活检的瘤组织，取材的部位非常重要。对于实体瘤患者，通常取原发癌组织或转移灶。有癌性胸、腹腔炎症的患者可取胸腔积液或腹水。白血病患者可取血液或骨髓液进行培养。

（一）实体瘤手术标本的取材方法

手术或活检切取的标本应立即浸入无血清培养液中，并及时进行培养。一般认为活组织样本越新鲜，癌细胞培养成功的机会越多。此外，应注意取未经任何治疗和没有坏死的样本进行培养为宜。如有溃疡或坏死则应尽可能避开，从癌组织深部取材。对有可能被真菌或细菌污染的癌组织，如口腔、消化道、呼吸道及泌尿生殖道等与外界相通的腔道部位，则应在培养前将样本放入含两性霉素B 2ug/ml，青霉素200～1000U/ml，链霉素500ug/ml的培养液中浸泡10～20分钟。然后，再用无血清培养液反复冲洗干净后，再作培养。对于一些特殊细胞培养的取材，详见后面相关章节。

（二）体腔液的取材方法

当胸腔积液、腹水中存在较多癌细胞时，可通过离心收集癌细胞进行培养。在无菌条件下抽取体腔液，不需要加抗凝剂，可直接以1200r/min离心5分钟收集细胞。不要久置，也不要在冰中冷却，而应尽早接种和培养。

（三）血液的取材方法

在急性白粤病及恶性淋巴瘤病例中，主要以外周血中的肿瘤细胞为培养对象。用加肝素（常用浓度为20U/ml )的注射器抽取5～l0ml外周血，置于灭菌的塑料尖底离心管中。立即将离心管置于37℃培养箱内，放置10～30分钟后，将不含红细胞的血浆部分移人另一支管中，以1200r/min离心5分钟，弃上清液，将细胞重新悬浮于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，以106/ml细胞密度接种培养瓶中，进行悬浮培养。

二、肿瘤细胞的分离方法

（一）细胞悬液的分离方法

当取材为血液、胸腔积液和腹水等细胞悬液时，可采用离心法分离肿瘤细胞。一般用500～1000r/min的低转速，时间约5～10分钟。如果一次离心样品量较多，可适当延长离心时间，但离心速度过快、离心时间过长均会对细胞造成损伤甚至引起死亡。

（二）实体瘤组织的分离方法

从实体瘤取出的各种组织均包含多种细胞成分，若要获得大量生长良好的目的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。目前分散组织的方法有机械和化学两种，要根据培养细胞种类的需要和培养要求，采用适宜的手段。对于一些特殊的肿瘤细胞，可能会同时采取多种分离手段相结合的方法，以达到理想的细胞分离目标。

1．机械分散法在对一些纤维成分很少的肿瘤组织进行培养时，可以直接用机械方法进行分散。可用眼科剪刀剪切后，用玻璃吸管反复吹打分散组织细胞；或将组织放到不锈钢网或尼龙筛网上，用注射器芯挤压通过筛网的方法。机械分散组织的方法简便易行，但对肿瘤细胞有一定的损伤，且仅限于处理纤维成分较少的软组织，对硬组织和纤维性组织效果不好。

2．剪切分离法在进行组织块移植培养时，可以采用剪切法，将组织用眼科剪子或者手术刀片剪切成小块（1～3 mm3 )，然后进行植块培养。

3．消化分离法消化法是结合生化和化学手段把已剪成较小体积的组织进一步分散的方法。以此法获得的细胞制成悬液可直接进行培养。消化作用可使组织松散、细胞分开，使肿瘤细胞容易生长，成活率高。各种消化试剂的作用机制各不相同，要根据肿瘤组织的类型和培养的具体要求选择消化方法和试剂。目前较为常用的消化试剂和方法如下：

(1)胰蛋白酶：胰蛋白酶是目前应用最广泛的组织消化分离试剂。适用于消化细胞间质较少的软组织，如肝、肾等组织。但对于纤维性组织和较硬的癌组织效果差。胰蛋白酶浓度一般为0.1％～0.5%，常用0.25%，一般pH为8.0。Ca²⁺和Mg 2+及血清均对胰蛋白酶的活性有抑制作用。消化过程中使用的液体，应不含这些离子及血清。为了提高消化效果，有时可以采用胰蛋白酶和EDTA联合消化的方法。EDTA的主要作用在于能从组织生存环境中吸取Ca²⁺,Mg²⁺,EDTA的浓度一般为0.02%，与胰酶混合的常用比例为1:1或2份EDTA加1份胰蛋白酶。需要特别注意的是，由于EDTA不能被血清等灭活，因而在使用EDTA消化后必须采取洗涤、离心的方法将其去除，否则EDTA在培养液中会改变Ca²⁺浓度，影响细胞的贴壁和生长。

(2）胶原酶：胶原酶是从溶组织梭状芽孢杆菌（Clostridium histolyticum）提取制备的，分为I,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ型，以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的肿瘤组织类型选择胶原酶类型，不分型的富含胶原酶多用于肿瘤细胞的分离。胶原酶对胶原的消化作用很强，它对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。Ca²⁺、Mg²⁺和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS或含血清的培养液配制，这样可使实验操作简便，同时能提高细胞成活率。但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。胶原酶的常用剂量为200U/ml约为1 mg/ml )或浓度为0.03％～0.3%。消化结束后要及时终止酶作用，制成细胞悬液前，须采用洗涤、离心的方法将其去除，再进行后续的培养。