激活素A(activinA）能够促进内胚层分化。维A酸（RA）参与胚胎内胚层分化的调节，尤其是胰岛芽基的形成，同时能够提高胰岛R细胞中胰岛素的生成。应用激活素A和RA联合其他因子可以诱导人ips成为胰岛素生成细胞。

【材料】

1.组织来源 人ips细胞系、人成纤维细胞IMR290为饲养层。

2．培养用试剂

（1）无钙镁PBS(CMF-PBS)。

(2）消化液：1g/ml的胶原酶Ⅳ。

3．培养基配方和制备

(1)人ips细胞定向分化胰岛细胞诱导培养基I:RPMI 1640培养基含有2% B27,11.1mM的葡萄糖、4nM activin A。

(2）人ips细胞定向分化胰岛细胞诱导培养基Ⅱ: RPMI 1640培养基含有0.1 mM的丁酸钠。

(3）人ips细胞定向分化胰岛细胞诱导培养基Ⅲ: RPMI 1640培养基含有2% B27,20ng/ml的EGF,2ng/ml bFGF和100ng/ml noggin（脑蛋白）。

(4）人ipS细胞定向分化胰岛细胞诱导培养基Ⅳ：RPMI 1640培养基含有0.5％牛血清清蛋白、l0mM的烟酰胺、50ng/ml胰岛素样生长因子Ⅱ。

4．实验器材平皿、显微剪、显微镊、手术刀片、六孔板。

【方法】

1．取材 将未分化ipS细胞克隆从MEF细胞上分离出来，加入人ipS细胞定向分化胰岛细胞诱导培养基I,37℃,5% C0₂饱和湿度培养箱培养7天。细胞换液，加入人ips细胞定向分化胰岛细胞诱导培养基Ⅱ培养1天。

2．消化 加入1g/ml的胶原酶Ⅳ于37℃水浴消化5分钟，加入含10% FBS的培养液终止消化，细胞悬液移至无菌离心管中，1000r/min离心5分钟，去上清液，重新将细胞悬液接种到六孔板中。

3．诱导 加入人ips细胞定向分化胰岛细胞诱导培养基培养Ⅲ，于37℃,5% CO₂饱和湿度培养箱培养2周。细胞换液，即ipS细胞定向分化胰岛细胞诱导培养基W，于37℃,5%,C0₂饱和湿度培养箱继续培养6天，使其重新贴壁。

【结果】

ips细胞分化的胰岛样细胞呈圆形或椭圆形，为悬浮生长，呈集落样，表面包有被膜。免疫组化染色显示胰岛素抗体阳性。

【注意事项】

序贯培养策略可将ips诱导分化为胰岛细胞。

ipS诱导分化为造血细胞

ips细胞经诱导分化，可表达造血细胞标记CD34, CD43和内皮细胞标记CD3,CD43，分化的细胞移植给镰刀型细胞贫血的小鼠中，结果显示移植细胞重建了小鼠的造血系统，而且将红细胞形态由原先的镰刀状修正为圆盘状。

【材料】

1．组织来源人ips细胞系、人成纤维细胞IMR290为饲养层。

2．培养用试剂

（1）无钙镁PBS (CMF-PBS )。

(2) 0.5g/L胶原酶V。

3．培养基配方和制备

(1)人ips细胞定向诱导分化造血细胞培养基I:DMEM含有20％胎牛血清、0.1 mM非必需氨基酸、0.1 nM β-巯基乙醇,1mM的L-谷氨酰胺、50ug/ml维生素C,201ug/ml人转铁蛋白。

(2）人ips细胞定向诱导分化造血细胞培养基Ⅱ:DMEM含有300ng/ml人干细胞因子、300ng/ml人Flt3-配体、lOng/ml人白细胞介素-3,10ng/ml人白细胞介素-6,50ng/ml G-CSF,50ng/ml人骨形态发生蛋白4 (human bone morphogenetic protein 4 , hBMP-4)。

4．实验器材平皿、显微剪、显微镊、手术刀片。

【方法】

1．取材将ips细胞培养液弃去，用CMF-PBS液冲洗。

2．消化加入0.5g/L胶原酶V于37℃水浴中消化5分钟，弃去消化液，加入含10%FBS的培养液终止消化，细胞悬液移至无菌离心管中，1000r/min离心5分钟，去上清液，重新将细胞悬液接种到六孔板中。

3．诱导加入人ips细胞定向诱导分化造血细胞培养基I，置37℃,5% C0₂饱和湿度培养箱培养1天。细胞换液，加入人ips细胞定向诱导分化造血细胞培养基Ⅱ,37℃,5% C0₂饱和湿度培养箱连续培养7天。

【结果】

ips细胞诱导的造血前体细胞悬浮于培养液中，胞体圆形，细胞核深染，核质比高，培养3～4天，细胞集落形成。

【注意事项】

严格控制胶原酶的作用时间，保证分离到的ipS细胞活性，提高诱导分化效率。