微囊藻毒素对环境及人类健康的危害己引起世界各国的普遍关注。1998年世界卫生组织（WHO）出版的《饮用水卫生基准》中建议饮用水中微囊藻毒素标准为1.0ug/L。英、美等国限定天然水体及饮用水中的微囊藻毒素含量为1.0ug/L。加拿大健康组织认为饮用水中可接受的微囊藻毒素标准为1.0ug/L。中国尚未制定饮用水中微囊藻毒素总含量标准，在2001年6月卫生部颁布的《生活饮用水卫生规范》中将MC-LR的浓度暂行基准值定为1.0ug/L。国家环境保护总局颁布的《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002）中在集中式生活饮用水地表水源地特定项目标准限值中列出MC-LR的标准值同样为1.0ug/L。因此需要灵敏高效的方法来检测水中微囊藻毒素的含量。目前微囊藻毒素的检测方法主要有化学仪器分析法（如高效液相色谱等）、生物化学法（如蛋白磷酸酶抑制试验）、免疫检测法（如ELISA）和生物检测法（如动物／细胞学试验）等。

一、化学仪器分析法

化学仪器分析方法主要利用藻类毒素分子结构上的特殊功能基团，如紫外发色团，分子量差异，极性或非极性等物理化学性质，实现对藻类毒素的定性定量分析。常见的方法有高效液相色谱法（HPLC-UV )、液相色谱质谱法（LC-MS)、毛细管电泳法（CE)、核磁共振法（NMR）等。

1.液相色谱法

基于UV光电管阵列检测器的HPLC法被广泛用于微囊藻毒素分析。其基本原理是微囊藻毒素在C18色谱柱上分离，通过紫外238 nm特征吸收进行检测。目前国内关于微囊藻毒素的标准方法大多基于HPLC，比如《水中微囊藻毒素的测定》(GB/T 20466-2006),《生活饮用水标准检验方法有机指标44项》(GB/T 5750.8-2006）和《生活饮用水卫生规范》(GB/T 5750-2001). 3个标准方法在检测的微囊藻毒素、流动相等方面有一定区别，如表8.2所示。

参考3种微囊藻毒素（LR, RR, YR）的液相色谱分析方法（GB/T 20466-2006)如下：

液相色谱条件：流动相为甲醇与磷酸盐缓冲溶液（体积比57:43)，色谱柱为C18反相柱，柱长250 mm，内径4.6 mm,填料粒径5um，柱温：40 ℃，流速1 ml/min,紫外检测器238 nm。在此条件下，3种微囊藻毒素实现基线分离，如图8.3所示。定量分析：用进样器分别吸取10ul标准系列溶液，注入高效液相色谱仪。在上述色谱条件下测定标准系列溶液的响应峰面积。以响应峰面积为纵坐标，标准系列溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。吸取10ul试样注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应峰面积（应在仪器检测的线性范围内）。依据测定的响应峰面积，在标准曲线上查出（或用回归方程计算出）水样中微囊藻毒素的含量。

在流动相中加入磷酸盐缓冲溶液可优化微囊藻毒素的峰形，提高色谱分析的重现性。另外乙酸铵、甲酸铵、甲酸等加入到流动相中，也可以起到类似磷酸盐的作用，而且这些化合物在甲醇或乙腈中有一定的溶解性，可延长色谱柱的寿命。以下是采用甲酸建立5种．微囊藻毒素（LR,RR,YR,LW和LF）的分析条件：ZORBAX SB-C 18色谱柱（2.1 X150 mm,3.5 um，美国安捷伦公司），流速0.3 ml/min，流动相为甲醇和含0.1％甲酸的水，梯度洗脱程序：0～7.5 min，甲醇浓度从50%增加到70%; 7.5～8.5 min，保持为70%; 8.5～20 min,保持为75%; 20～30 min，恢复50％初始浓度，柱温30 ℃，紫外检测波长为238 nm。

图8.4显示在20 min内5种微囊藻毒素实现基线分离，RR, YR, LR, LW和LF依次出峰。LW和LF在色谱柱上的保留时间明显大于RR, YR和LR。这与LW和LF的色氨酸（W）和苯基丙氨酸（F）侧链所特有的苯环有关，苯环的存在增加了LW和LF与C₁₈固定相之间的疏水作用，因而提高了其在色谱柱上的保留能力。由于梯度洗脱条件下流动相的甲酸含量变化，导致基线明显漂移。此条件下基线漂移具有良好的重现性，对定量影响较小。另外也可考虑在甲醇和水中同时加入甲酸至0.1％含量，抑制基线的漂移。

由于实际水样成分复杂，微囊藻毒素分析易受到干扰，得到假阳性结果。除了色谱上的保留时间，还可以通过光电二极管阵列检测器得到的紫外全波长扫描图，进行定性分析，确定微囊藻毒素种类。图8.5为5种常见微囊藻毒素的紫外全波长扫描图。MC-LR, RR和LF具有相同的紫外全波长扫描图，特征吸收峰为240 nm; YR的特征吸收波长为232 nm;LW具有两个特征吸收波长：220 nm和240 nm。根据紫外全波长扫描图，可以初步鉴定微囊藻毒素的种类。

采用液相色谱法分析微囊藻毒素需要注意3个问题。①使用多种微囊藻毒素标样建立分析方法，保证在C18色谱柱上使保留时间相近的微囊藻毒素（如微囊藻毒素LR. RR和YR）达到基线分离。在仪器分析上一定程度排除不同微囊藻毒素之间的干扰，提高分析结果的准确性。②采样、前处理和分析过程中，避免使用塑料材质的器材。塑料中的溶出物会干扰分析，产生假阳性结果。Miyoshi Ikawa等发现塑料中的间苯二酚单苯甲酸酯和2,4-二羟基二苯甲酮可干扰MC-LR的测定，而双酚A可干扰MC-YR的测定。③在前处理中，微囊藻毒素重溶的溶剂中需要有一定比例的有机相，比如75％甲醇/25％水。由于微囊藻毒素具有一定的疏水性，在过滤中会吸附到滤膜中，提高溶剂中有机相比例可以抑制在滤膜上的吸附，提高回收率。

虽然HPLC是微囊藻毒素分析中己是比较成熟且应用最广泛的方法，但是依旧存在一些缺点，阻碍其进一步应用。首先，HPLC在微囊藻毒素的定性和定量分析中，需要相应的标准品。而目前发现的微囊藻毒素中，商品化的微囊藻毒素标准品只有寥寥凡种，因此无法使用HPLC分析剩余的大部分微囊藻毒素。其次，由于微囊藻毒素结构上的相似，造成在200～300 nm波长下有类似的吸收情况，因此不能采用紫外全波长扫描法完全区分如此众多的微囊藻毒素。最后，由于自然界中大部分物质存在紫外吸收能力，因此HPLC分析中容易受到干扰，产生假阳性结果，这种情况在稍微复杂，水样分析中经常发生。