1范围

本标准规定了水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留量的液相色谱测定方法。

本标准适用于水产品可食部分中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留量的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682   分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3. 1

孔雀石绿 malachite green

属于三苯甲烷染料类,分子式为C₂₃H₂₅CIN₂，绿色结晶体。

注:孔雀石绿的结构式见附录A。

3.2

无色孔雀石绿 leucomalachite green

N, N-二甲基苯胺，孔雀石绿在水生生物体中的主要代谢产物,分子式为C₂₃H₂₆N₂。

注:无色孔雀石绿的结构式见附录A。

4原理

以乙酸胺盐溶液和乙腈提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿后,经过液-液萃取、固相萃取,用接有氧化柱的C₁₈柱进行高效液相色谱分析,外标法定量。

5试剂

5. 1所有试剂应无干扰峰，应选择优级纯或色谱纯的试剂,分析纯试剂应重蒸。

5. 2孔雀石绿及无色孔雀石绿标准品:孔雀石绿纯度 ≥ 90%,无色孔雀石绿纯度 ≥ 90%。

5. 3乙腈:色谱纯。

5. 4二氯甲烷:分析纯。

5.5盐酸羟胺溶液：0.25g/mL。

5. 6二甘醇:分析纯。

5. 7 乙酸铉溶液:0. 1 mol/L(pH 4. 5),0. 125 mol/L(pH 4. 5)

5. 8对甲苯磺酸溶液:0. 05 mol/L。

5. 9碱性氧化铝:分析纯，粒度0. 071 mm~0. 150 mm。

5. 10中性氧化铝:分析纯，粒度0. 071 mm~0. 150 mm。

5. 11 丙基磺酸阳离子树脂:PRS(propylsulfonic acid) ,40 μm。

5. 12孔雀石绿标准溶液:准确称取孔雀石绿0. 100 0 g,用乙腈溶解,定容于100 mL容量瓶中，使成浓度为1 mg/mL的标准溶液，再用乙腈稀释成0. 1 μg/mL的工作溶液。该溶液应避光保存。

5.13无色孔雀石绿标准溶液:准确称取无色孔雀石绿0. 100 0 g,用乙腈溶解,定容于100 mL容量瓶中, 使成浓度为1 mg/mL的标准溶液，再用乙腈稀释成0.1μg/mL的工作溶液。该溶液应避光保存。

5. 14二氧化铅:分析纯。

5.15硅藻土:精制工业硅藻土。

5.16水:应符合GB/T 6682的要求。

6仪器

6.1高效液相色谱仪:配可变波长检测器。

6.2电子天平:感量0. 000 1 g。

6.3匀浆机。

6. 4离心机。

6. 5振荡器。

6.6旋转蒸发器。

6.7固相萃取柱:PRS柱，中性氧化铝柱。

6. 8色谱柱:C₁₈柱。

6.9柱后氧化柱:柱内填料:二氧化铅:硅藻土=1 : 1。

7操作方法

7.1样品处理

7. 1. 1取样

鱼去鳞、皮，沿背脊取肌肉；虾去头、壳，取可食肌肉部分;蟹、甲鱼等取可食部分。所取样品切为不大于0. 5 cm×0. 5 cm×0. 5 cm的小块后混匀。

7.1.2称取样品10 g〜20 g(精确至0. 001 g),置于匀浆杯中，向杯中依次加3 mL盐酸羟胺溶液、5 mL 对甲苯磺酸溶液和20 mL 0. 1 mol/L的乙酸铵溶液，匀浆2 min,转移到250 mL三角瓶中，用60 mL乙腈洗涤匀浆杯，洗涤液合并到三角瓶中，加入20 g碱性氧化铝,用振荡器振荡5 min,转移至4支50 mL离 心管内，30mL乙腈洗涤三角瓶后转移到离心管中,4 000 r/min离心15 min

7.2分离纯化

7. 2. 1液-液萃取

7.2. 1. 1将离心管上清液移入分液漏斗中，向离心管中加入乙腈，洗涤，离心(4 000 r/min, 15 min),合 并上清液到分液漏斗中,并加入100 mL水、50 mL二氯甲烷和2 mL二甘醇，剧烈振摇分液漏斗，静置 1 h。

7.2. 1. 2用蒸发瓶收集下层液体后，再往分液漏斗加入50 mL二氯甲烷，振摇，静置约10 min,待其分层 后收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液在35°C下减压旋转蒸发(注意:开始时温度不要直接升到35°C , 以免爆沸)至体积2 mL〜3 mL。

7. 2.2固相柱萃取

7. 2. 2. 1固相柱制备

采用中性氧化铝(1 g)、PRS填料(0. 5 g)分别装填2只固相萃取柱，按中性氧化铝柱在前、PRS柱在后的顺序将两柱串联。

7. 2. 2. 2 上样

使用前用5 mL乙腊预洗两柱，然后将7. 2. 1. 2浓缩液体加入5 mL乙腈混匀后，缓慢加入中性氧化铝柱内(注意:不要引起柱表面填料浮动)。再用5 mL乙腈洗涤蒸发瓶2次，2次洗涤液均加入柱内，最后用5 mL乙腈洗涤两柱。

7. 2. 2. 3洗脱收集

 

文章来源：《水产品兽药残留限量及监测方法查询手册》

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