3 离效液相色谱法

3.1 原理

试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-二氧化铅柱后衍生测定，外标法定量。

3.2 试剂和材料

除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。

3.2.1 乙腈：液相色谱纯。

3.2.2 二氯甲烷。

3.2.3 甲醇：液相色谱纯。

3.2.4 乙酸盐缓冲液：溶解4.95g无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸于950mL水中，用冰乙酸调节溶液pH到4.5，最后用水稀释到1L。

3.2.5 20%盐酸羟胺溶液。

3.2.6 1.0mol/L对-甲苯磺酸：称取17.2g对-甲苯磺酸，并用水稀释至100mL。

3.2.7 50mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH到4.5。

3.2.8 二甘醇。

3.2.9 酸性氧化铝：80目〜120目。

3.2.10 二氧化铅。

3.2.11 硅藻土545：色谱层析级。

3.2.12 标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV），纯度大于98%。

3.2.13 标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成100Mg/mL的标准储备液，再用乙腈稀释配制1μg/mL的标准溶液。一18°C避光保存。

3.2.14 混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液。一18°C避光保存。

3.3 仪器和设备

3.3.1 高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。

3.3.2 匀浆机。

3.3.3 离心机：4000r/min。

3.3.4 固相萃取装置。

3.3.5 25%二氧化铅氧化柱：不锈钢预柱管［5cmX4mm（内径）］，两端附2μm过滤板，抽真空下，填装含有25%二氧化铅的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。临用前用甲醇冲洗。并将二氧化铅氧化柱连接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间。

3.3.6 酸性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。

3.4 样品制备

3.4.1 提取

称取5.00g样品于50mL离心管内，加入1.5mL20%的盐酸羟胺溶液，2.5mL1.0mol/L的对-甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10000r/min的速度均质30s，加入10mL乙腈剧烈振摇30s。加入5g酸性氧化铝，再次振荡30s。3000r/min离心10mm。把上清液转移至装有10mL水和2mL二甘醇的100mL离心管中。然后在50mL离心管中加入10mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。

3.4.2 净化

在离心管中加入15mL二氯甲烷，振荡10s，3000r/min离心10min，将二氯甲烷层转移至100mL的梨形瓶中，再用5mL乙腈、10mL二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100mL梨形瓶中。45°C旋转蒸发至约1mL，用2.5mL乙腈溶解残渣。

将酸性氧化铝柱（3.3.6）安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤瓶2次，每次2.5mL，把洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，45°C旋转蒸发至近干，残液准确用0.5mL乙腈溶解，过0.45滤膜，滤液供液相色谱测定。

3.5 测定

3.5.1 液相色谱条件

a） 色谱柱：C18柱，250mmX4.6mm（内径），粒度5μm，在C18色谱柱和检测器之间连接25%二氧化铅氧化柱；

b） 流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液（3.2.7），梯度洗脱参数见表1；

c） 流速：1.0mL/min；

d） 柱温：室温；

e） 检测波长：618nm（孔雀石绿），588nm（结晶紫）；

f） 进样量：50μL。

3.5.2 液相色谱测定

根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min，7.88min、17.77min、18.22min，标准品色谱图参见附录A中图A.2。

3.6 空白试验

除不加试样外，均按3.4，3.5步骤进行。

3.7 结果计算和表述

按式（2）计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。计算结果需扣除空白值。

 

式中：

X——样品中待测组分残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

c—待测组分标准工作液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；

A——样品中待测组分的峰面积；

As——待测组分标准工作液的峰面积；

V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m——最终样液所代表的试样量，单位为克(g)。

本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量之和，以孔雀石绿表示。

本方法结晶紫的残留量测定结果系指结晶紫和它的代谢物隐色结晶紫残留量之和，以结晶紫表示。

3.8 方法检测限

本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为2.0μg/kg。

 

文章来源：《水产品兽药残留限量及监测方法查询手册》

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