7 测定步骤

7.1 样品预处理

鱼去鳞、皮，沿背脊取肌肉身；虾去头、壳、附肢，取可食肌肉部分；蟹、中华鳖等取可食肌肉部分；样品切为不大于0.5cmX0.5cmX0.5cm的小块后混匀，放置冰箱中冷冻储存备用。

7.2 提取

将样品解冻，称取样品5g（精确至0.001g），置于50mL玻璃离心管中，加入乙酸乙酯20mL，均质机均质1min，分散均匀，提取氯霉素，4000r/min离心3min，将乙酸乙酯层转移到100mL细口鸡心瓶中。再向离心管中加乙酸乙酯10mL，用原均质机均质混合1min，4000r/min离心3min，合并乙酸乙酯提取液于100mL细口鸡心瓶中，于40°C水浴中减压旋转蒸发至干。

注：均质机清洗方法，先用大量水浸洗，再用甲醇浸洗，最后用蒸馏水浸洗。

7.3 脱脂净化

向鸡心瓶中加1mL甲醇涡旋混合溶解残留物，再加入15mL正己烷和25mL4%氯化钠溶液，盖塞振荡混合1min，充分混合提取脂肪，转移到另一50mL离心管中，4000r/min的速度离心2min，除去上层正己烷相并弃去。再向水相中加10mL正己烷，重复提取一遍，弃去正己烷相。

水相中加入15mL乙酸乙酯，涡旋混合器混合2min，3000r/min离心3min，吸取乙酸乙酯层，经过无水硫酸钠柱脱水过滤于50mL鸡心瓶中。再向水相中加入5mL乙酸乙酯，重复上述操作。用少量乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱，合并提取液于50mL鸡心瓶中，在40°C水浴中减压旋转蒸发至干。对于大部分样品，到此步骤净化效果已可达到要求，对于净化不完全的样品可经C18固相萃取柱进一步净化。

加入2mL乙酸乙酯溶解提取物并转移于5mL具塞离心管中.用1mL乙酸乙酯洗涤鸡心瓶，合并乙酸乙酯，于50°C~55°C的砂浴中吹氮蒸发至近干，再用1mL乙酸乙酯洗涤离心管壁并吹干。注意防潮。

7.4 C18柱净化

注意：以下步骤必须连续做完，切莫让吸附剂变干。

给每个样品准备一根C18柱，顺序用5mL甲醇、5mL氯仿、5mL甲醇和5mL水淋洗活化C18柱，弃掉洗涤液。用5mL体积分数为5%的乙腈水溶液溶解7.3中在40°C水浴中减压旋转蒸发至干的提取物，吸取水溶液装入C18柱过柱，弃掉流出液。注意流速保持每秒一滴，否则净化效果和回收率都较差。用1mL水淋洗鸡心瓶2遍，并将淋洗液加入C18柱过柱，弃掉流出液。用5mL水淋洗C18柱，让洗涤液完全流出C18柱，用微氮吹干。用乙腈将08柱中的氯霉素洗脱，洗脱2次，每次1.5mL，合并洗脱液于5mL具塞离心管中。在温度50°C~55°C的砂浴中，用氮气吹除乙腈至近干，再用1mL乙腈洗涤离心管壁并用氮气吹干。注意防潮。

7.5 衍生化

7.5.1 试样的衍生化

向干的残留物中加100μL衍生化试剂，盖塞并涡旋混合10s，在70°C烘箱中反应30min。再在50°C〜55°C砂浴中，用氮气流吹除多余的试剂，至样品管刚好吹干为止(注意：此步过长的吹干时间可导致丢失分析物)。加入0.5mL正己烷，涡旋混合10s，供气相色谱分析用。

7.5.2 标准工作液的衍生化

取适量标准工作液于5mL具塞离心管中，在温度50°C~55°C的砂浴中，用氮气吹除溶剂至干。以下按7.5.1的步骤操作。

7.6 样品测定

分别注入1μL适当浓度的氯霉素标准硅烷化衍生物溶液及样品提取物硅烷化衍生物溶液于气相色谱仪中，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准样品的保留时间定性，外标法定量。

7.7 计算

样品中氯霉素的含量按式(1)计算。

式中：

X——样品中氯霉素含量，单位为微克每千克( μg/kg)；

cs——标准衍生物溶液相当氯霉素含量，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

A——试样液中氯霉素衍生物的峰面积或峰髙，单位为微伏秒或毫米( μV•s或mm)；

V——样品提取物衍生化溶液体积，单位为毫升(mL)；

As——氯霉素标准衍生物的峰面积或峰高，单位为微伏秒或毫米( μV•s或mm)；

m——样品质量，单位为克(g)。

注：计算结果需扣除空白值。

8 方法回收率

标准添加浓度为0.1μg/kg〜20.0μg/kg时，回收率≥70%。

9 方法检测限

本方法检测限：0.3μg/kg。

10 允许差

2次平行测定结果相对偏差≤15%。

11 方法的线性范围

本方法的线性范围：标准衍生物溶液相当氯霉素浓度为0.5ng/mL〜250ng/mL。

 

 

文章来源：《水产品兽药残留限量及监测方法查询手册》

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