2.4 样品制备

2. 4. 1 鲜活水产品

2.4.1. 1 提取

称取5.00 g已捣碎样品于50 mL离心管中，加入200 μL混合内标标准溶液(2. 2. 19)，加入11 mL 乙腈，超声波振荡提取2 min，8 000 r/min匀浆提取30 s，4 000 r/min离心5 min，上清液转移至25 mL 比色管中；另取一 50 mL离心管加入11 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10 s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，涡旋振荡器上振荡30 s，超声波振荡5 min，4 000 r/min离心5 min，上清液合并至 25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，摇匀备用。

2.4.1.2 净化

移取5. 00 mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱(2. 2.14)上，用KD浓缩瓶接收流出液，4 mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，45°C旋转蒸发至约1 mL，残液用乙腈定容至1.00 mL，超声波振 荡5 min，加入1. 0 mL 5 mmol/L乙酸铵，超声波振荡1 min，样液经0. 2呻滤膜过滤后供液相色谱-串 联质谱测定。

2.4.2 加工水产品

2. 4. 2. 1 提取

称取5.00 g已捣碎样品于100 mL离心管中，加入200μL混合内标标准溶液(2. 2. 19)，依次加入 1 mL盐酸羟胺(2. 2. 9)，2 mL对-甲苯磺酸(2. 2. 10).2 mL乙酸铵缓冲溶液(2.2.6)和40 mL乙腈，匀 浆2 min(10 000 r/min)，离心3 min(3 000 r/min)，将上清液转移到250 mL分液漏斗中，用20 mL乙腈重复提取残渣一次，合并上清液。于分液漏斗中加入30 mL二氯甲烷、35 mL水，振摇2 min，静置分 层，收集下层有机层于150 mL梨形瓶中，再用20 mL二氯甲烷萃取一次，合并二氯甲烷层，45°C旋转 蒸发近干。

2.4.2.2 净化

将中性氧化铝柱(2. 2. 14)串接在阳离子交换柱(2. 2. 13)±方。用6 mL乙腈分3次(每次2 mL)，用 涡旋振荡器涡旋溶解上述提取物，并依次过柱，控制阳离子交换柱流速不超过0.6mL/mm，再用2 mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后，弃去中性氧化铝柱。依次用3 mL体积分数为2%的甲酸溶液、3 mL乙腈淋洗阳 离子交换柱，弃去流出液。用4 mL体积分数为5%的乙酸铵甲醇溶液(2. 2.12)洗脱，洗脱流速为 1 mL/min，用10 mL刻度试管收集洗脱液，用水定容至10. 0 mL，样液经0. 2μm 滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱测定。

2.5 测定

2.5. 1 液相色谱-串联质谱条件

a）   色谱柱:C18柱，50 mmX2.1 mm（内径），粒度3μm；

b）   流动相：乙腈+5 mmol/L乙酸铵= 75+25（体积比）；

c）   流速：0. 2 mL/min；

d）   柱温：35°C；

e）   进样量：10 μL；

f）   离子源：电喷雾ESI，正离子；

g）  扫描方式：多反应监测MRM；

h）  雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；

i）  喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度；

j）  监测离子对:孔雀石绿m/z 329/313（定量离子）.329/208；隐色孔雀石绿m/z 331/316（定量离子），331/239；结晶紫m/z 372/356（定量离子），372/251；隐色结晶紫m/z 374/359（定量 离子）、374/238；氘代孔雀石绿m/z 334/318（定量离子）；氘代隐色孔雀石绿m/z 337/322（定 量离子）。

2.5.2 液相色谱-串联质谱测定

按照2. 5. 1液相色谱-串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液（2. 2. 20），以色谱峰面积按内标法 定量，孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算，隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿 为内标物计算。在上述色谱条件下孔雀石绿、氘代孔雀石绿、结晶紫、氘代隐色孔雀石绿、隐色孔雀石绿和 隐色结晶紫的参考保留时间分别为2. 27 min、2. 30 min，2. 88 min、5.21 min，5. 31 min、5. 61 min，标准溶液的离子流图参见附录A中图A. 1。

2.5.3 液相色谱-串联质谱确证

按照2. 5.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值，仅当两者数值的相对偏差小于25%时方可确定两者为同一物质。

2.6 空白试验

除不加试样外，均按2. 4、2. 5步骤进行。

2.7 结果计算和表述

按式（1）计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。计算结果需扣除空白值。

式中：

X——样品中待测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；

c ——孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫标准工作溶液的浓度，单位为微克每升（μg/L）；

Csi——标准工作溶液中内标物的浓度，单位为微克每升（μg/L）；

Ci——样液中内标物的浓度，单位为微克每升（μg/L）；

As——孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫标准工作溶液的峰面积；

A ——样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫的峰面积；

Asi——标准工作溶液中内标物的峰面积；

Ai——样液中内标物的峰面积；

V ——样品定容体积，单位为毫升（mL）；

m——样品称样量，单位为克（g）。

本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量之和，以孔雀石绿表示。

本方法结晶紫的残留量测定结果系指结晶紫和它的代谢物隐色结晶紫残留量之和，以结晶紫表示

2.8 方法检测限

本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为0. 5μg/kg。

 

文章来源：《水产品兽药残留限量及监测方法查询手册》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。