一、实训目标

1．掌握HPLC仪器的基本操作；

2．学会选择HPLC最佳分析条件的方法。

二、实训原理

维生素E(VE）主要有α、β、γ和δ4种异构体，其中又以α-异构体的生理作用为最强。其天然品为右旋体（d-a)，合成品为消旋体（d1-a)，一般药用为合成品。药典中收载为维生素E、dl-生育酚及其醋酸酯与琥珀酸钙盐、d1-a生育酚及其醋酸酯与琥珀酸酯。通常维生素E是一个混合物，除了游离的生育酚梭酸醋可能同时存在外，也可能共存多种结构异构体，甚至还可能有其他共存有机物。

维生素E的分离既可以用反相HPLC，也可以用正相HPLC。本实验采用正相HPLC。

正相HPLC用的是极性填料分离柱（如硅胶柱），流动相是弱极性或非极性溶剂（如正己烷），样品因吸附作用在固定相中保留。在非极性溶剂中适当添加少量极性溶剂可以得到任意所需极性的流动相，使各个组分可以得到更好的分离。色谱分析条件主要包括色谱柱及色谱柱温度的选择、流动相组成与流速、检测波长等。通过实验主要了解流动相中添加极性溶剂对样品的保留和分离的影响，目的是将a-VE与其他成分分离。

三、实训仪器与试剂

1．仪器

PE200型高效液相色谱仪或其他型号液相色谱仪；紫外检测器；色谱数据工作站；超声波清洗器；流动相过滤器；无油真空泵；容量瓶；平头微量注射器（100μL)；移液管。

2．试剂
异丙醇；正己烷和无水乙醇（色谱纯）；a-VE标准样品（分析纯）；混合维生素E；蒸馏水（二次蒸馏水）。

四、实训步骤

1．流动相的预处理

取色谱纯异丙醇200mL、正己烷1000mL，用0.45μm的有机滤膜过滤后，装入流动相贮液器内，用超声波清洗器脱气10-20min。

2．试样和标样的预处理

取色谱纯无水乙醇1000mL，用0.45μm的有机滤膜过滤后，置于试剂瓶中备用。取二次蒸馏水500mL，用水相滤膜过滤后，置于聚乙烯中，备用。

(1)混合维生素E试样贮备液称取混合维生素E试样400-500mg（准确至0.1mg)于一洁净100mL的烧杯中，用处理过的无水乙醇溶液溶解并定容至l00mL的容量瓶中，摇匀备用。

(2)混合维生素E试样溶液移取10.00mL试样贮备液于一100mL容量瓶中，用处理过的无水乙醇溶液溶解至刻度，摇匀备用。

(3)1.0mg/mLa-VE标准贮备溶液称取a-VE标准样品500mg（准确到0.lmg）于一洁净l00mL烧杯中，用处理过的无水乙醇溶液溶解并定容至500mL的容量瓶中，摇匀备用。

(4)0.lmg/mLa-VE标准溶液移取10.00mL标样贮备液于一100mL容量瓶中，用处理过的无水乙醇溶液定容至l00mL，摇匀备用。

3．高效液相色谱仪的开机及操作条件

(1)按仪器说明书依次打开高压输液泵、紫外检测器、智能型接口的电源；打开色谱工作站，建立一个运行方法，同时建立一个序列方法（序列数以当日要做实验的数目为准）。

(2)操作条件

(3)装上本次实验所用的硅胶柱MicropakSi-5(4mm×150mm),先用纯的正己烷作流动相，打开输液泵旁路开关，排出流路中的气泡。排气完毕后，按“stop”键将泵停止，确认流速设定值是否正确（1.0mL/min)，然后再按“start”按钮启动输液泵。

4．流动相为100％正己烷时试样和标样的分析

(1)混合VE试样溶液的测定

①进样。待基线稳定后，用100μL平头微量注射器取试样溶液25μL，将进样阀柄置于"Load"位置时注入样品，在泵、检测器、接口、工作站均“Read”的状态下将阀柄转至“Inject”位置，仪器自动采样。

②数据采集。从计算机的显示屏上即可看到样品的流出过程和分离状况。待所有的色谱峰流出完毕后，按“stop”键停止分析（运行时间结束后，仪器也会自动停止采样），记录好样品名对应的文件名。

③谱图优化。从工作站中调出原始谱图，对谱图进行优化处理后，打印出色谱图和分析结果。平行测定三次。

(2)a-VE标准溶液的测定用10μL平头微量注射器吸取a-VE标准溶液25μL，按混合试样的测定方法进行分析测定，记录好样品名对应的文件名，并打印出色谱图和分析结果。平行测定三次。

5．流动相为正己烷／异丙醇（体积比99/1)混合溶剂时试样和标样的分析将流动相换成正己烷／异丙醇（体积比99/1)混合溶剂，待基线稳定后，按混合试样的
测定方法对混合维生素E试样和a-VE标样进行分析测定，并记录好样品名对应的文件名，同时打印出色谱图和分析结果。平行测定三次。

6．流动相为正己烷／异丙醇（体积比为95/5)混合溶剂时试样和标样的分析将流动相换成正己烷／异丙醇（体积比为95/5)混合溶剂，待基线稳定后，按混合试样的测定方法对混合维生素E试样和a-VE标样进行分析测定，并记录好样品各对应的文件名，同时打印出色谱图和分析结果。平行测定三次。

7．数据处理

根据实验结果确定a-VE与其他成分分离的最佳环己烷／异丙醇配比。

8．结束工作

(1）关机

①所有样品分析完毕后，让流动相继续流动10-20min，以免色谱柱上残留样品中的强吸附的杂质。

②关闭色谱数据工作站。

③关闭接口、检测器电源、关泵。

(2)清理台面，填写仪器使用记录。

五、注意事项

(1)各实验室的仪器设备不可能完全一样，操作时一定要参照仪器的操作规程。

(2)实验中平头微量注射器用蒸馏一水或溶剂清洗3次后，再用样品溶液清洗3次，并注意不要吸入气泡。用平头微量注射器吸液时，防止气泡吸入的方法是：将擦干净并用样品清洗过的注射器插入样品液面以下，反复提拉数次，驱除气泡，然后缓慢提升针芯到刻度。

(3)色谱柱的个体差异很大，即使是同一厂家的同种型号的色谱柱，性能也会有差异。因此，色谱条件（主要是指流动相的配比）应根据所用色谱柱的实际情况作适当的调整。

(4)如果仪器长期停用，完成实验后还应卸下色谱柱，将色谱柱两头的螺帽套紧，先用水再用异丙醇冲洗泵，确保泵头内灌满异丙醇；从系统中拆下泵的输出管，套上管套；从溶剂贮液器中取出溶剂入口过滤器放入干净袋中；妥善保存好泵。

(5)根据色谱柱说明书上的指导清洗柱子，从泵和系统中除去有害的流动相；用水冲洗系统中缓冲液盐类，以免溶剂蒸发留下盐结晶等有害沉淀；从系统中除去氯仿及其配成的溶液。以免在系统中分解，形成盐酸；除去有害流动相后，用异丙醇冲洗泵及系统；同时注意溶剂在环境中暴露24h以上，必须在使用前再过滤或弃去，以免污染泵。

(6)周末停用仪器，可用60/40的甲醇／水冲洗泵，柱子和流动池（柱子要和甲醇／水兼容）。

(7)脱气时贮液器底部要用橡皮垫圈。本实验中注入流动相之前，弄清仪器前次实验所用的流动相，如果是用含水的流动相作过反相色谱，则应先将反相柱卸下（应用专门的柱塞封好柱两端），依次用无水甲醇、正己烷作流动相运行15-20min，洗净流路中的水。进样器也要进行同样的清洗（以无水甲醇和正己烷为样品依次各注入3-5次）。

(8)所谓谱图优化是指调整基线、噪声、采样速率以及积分参数等。

(9)如果分析速度慢，可适当增加固定液的流速，并观察分离效果。