一、实训目标

1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握高效液相色谱仪的基本操作；

2．熟悉高效液相色谱仪仪器性能检查的项目和方法；

3．掌握液相色谱柱性能指标（如理论塔板数、峰不对称因子、柱的反压等）的测定方法，学会判别其性能优劣。

二、实训原理

1．高效液相色谱仪的性能指标

(1)流量精度仪器流量的准确性，以测量流量与指示流量的相对偏差表示。

(2)检测限本实验使用紫外检测器，其检测限为某组分产生的信号大小等于2倍噪声时，每毫升流动相所含该组分的量。

(3)定性重复性在同一实验条件下，组分保留时间的重复性，通常以被分离组分的保留时间之差的相对标准偏差来表示（RSD≤1％认为合格）。

(4）定量重复性在同一实验条件下，组分色谱峰峰面积（或峰高）的重复性，通常以被分离组分的峰面积的相对标准偏差来表示（RSD≤2％认为合格）。

2．液相色谱柱的性能指标

一支色谱柱的好坏要用一定的指标来进行评价。通常评价色谱柱的主要指标包括：理论塔板数N；峰不对称因子；两种不同溶质的选择性（(a)；色谱柱的反压；键合固定相的浓度；色谱柱的稳定性等。一个合格的色谱柱评价报告至少应给出色谱柱的基本性能参数，如柱效能（即理论塔板数N)、容量因子k、分离度R、柱压降等。

评价液相色谱柱的仪器系统应满足相当高的要求：一是液相色谱仪器系统的死体积应尽可能小；二是采用的样品及操作条件应当合理，在此合理的条件下，评价色谱柱的样品可以完全分离并有适当的保留时间。不同类型色谱柱性能评价所需的样品与所采用的操作条件是不同的，可查阅相关参考资料。

三、实训仪器与试剂

1．仪器

PE200型高效液相色谱仪或其他型号液相色谱仪（普通配置，带紫外检测器）；TC4色谱工作站或其他色谱工作站；色谱柱［PEBrownleeC18反相键合相色谱柱（5μm,4.6mmi.d.×150mm)];100μL平头微量注射器；超声波清洗器；流动相过滤器；无油真空泵；容量瓶等玻璃仪器。

2．试剂

苯；萘；联苯；菲（A.R.）；甲醇(HPLC纯）；蒸馏水等。

四、实训步骤

1．准备工作

(1）流动相的预处理配制甲醇-水（体积比83：17)的流动相，用0.45μm的有机滤膜过滤后，装入流动相贮液器内，用超声波清洗器脱气10-20min（如果仪器带有在线脱气装置，可不必采用超声波清洗器脱气）。

(2）标准溶液的配制配制含苯、蔡、联苯、菲各l0μg/mL的正己烷溶液，混匀备用。

(3)观察流动相流路，检查流动相是否够用，废液出口是否接好。

(4)高效液相色谱仪的开机按仪器操作说明书规定的顺序依次打开仪器各单元，打开输液泵旁路开关，排出流路中的气泡，启动输液泵，并将仪器调试到正常工作状态，流动相流速设置为1.0mL/min，检测器波长设为254nm。同时打开工作站电源并启动系统软件。

2．高效液相色谱仪仪器性能测试

(1)流量精度的测定以甲醇为流动相，设置其流量为1.0mL/min。待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的称量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集10mL，记录流出所需时间，并将其换算成流速（mL/min)，重复3次，记录相关数据。

(2)检测限的测定在基线稳定的条件下，用进样器注入一定量浓度为4×10-8g/mL的萘的甲醇溶液，样品峰高应大于或等于2倍基线噪声峰高，按下式计算该仪器最小检测浓度。

c1＝2×hN×c/h

式中c1——最小检测浓度，g/mL;

hN——噪声峰高；

c——样品浓度，g/mL;

h——样品峰高。

(3)重复性的测定将仪器连接好，使之处于正常工作状态，用进样阀的定量管注入适当的标准溶液（蔡或联苯）或稳定的待分析样品溶液，记录保留时间和峰面积相关数值。连续测量5次，计算相对标准偏差RSD。

3．色谱柱性能的测定

(1)待基线稳定后，用平头微量注射器进样（进样量由进样阀定量管确定），将进样阀柄置于“Load"位置时注入样品，在泵、检测器、接口、工作站均正常的状态下将阀柄转至“Inject”位置，仪器开始采样。

(2)从计算机的显示屏上即可看到样品的流出过程和分离状况。待所有的色谱峰流出完毕后，停止分析（运行时间结束后，仪器也会自动停止采样），记录好样品名对应的文件名（已知出峰顺序为苯、萘、联苯、菲）。

(3)重复进样不少于三次。

4．结束工作

待所有样品分析完毕后，让流动相继续运行20-30min，以免样品中的强吸附杂质残留在色谱柱中。

5．数据记录及处理

(1)流量精度的测定将流量精度测定的相关数据填入下表中，并计算平均流量和相对标准偏差。

(2)检测限的测定记录检测限测定的相关数据，并进行相关计算。

样品峰高h;

噪声峰高hN：

最小检测限：c1=2×hNc/h=

(3)重复性的测定将重复性测定的相关数据填入下表中，并计算平均值和相对标准偏差。

五、注意事项

(1)操作时需严格遵守实验室实验要求及仪器操作规程。

(2)开泵前应检查流路中的气泡，并确保排除干净。