蚕豆（Viciafaba)根尖细胞的染色体大，DNA含量多，对诱变剂反应敏感。蚕豆根尖微核技术是1982年由Francesca和MaTe-Hsiu建立的，在环境污染监测和致突变剂检测研究中得到广泛应用。

1．仪器设备

显微镜、温箱、恒温水浴锅、冰箱、记数器、解剖盘、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、试剂瓶、烧杯等。

2．受试生物材料

推荐的蚕豆品种为松滋青皮豆，是筛选出的较为敏感的品种。可采用直接购买或引种栽培繁殖的方法。

引种松滋青皮豆时，注意不要与其他蚕豆品种混种，不施用农药和化肥，以保持其较低的本底微核值。种子成熟晒干后，为保证其发芽率，应贮于干燥器内，或用牛皮纸袋装好后，放入4℃冰箱内保存备用。

如果只需对区域性水环境进行监测，也可用其他蚕豆品种。但应注意其来源稳定、可靠。同时注意经常检查其敏感性，以保证监测数据的历史连续性和可比性。

3.试验程序

（1)试剂配置

①5mol/LHCl。

②卡诺氏液：无水乙醇（或95％乙醇）3份加冰乙酸1份配成。固定根尖时随用随配。

③席夫氏（Schiff）试剂：称0.5g碱性品红（FuchsinBasic）加蒸馏水l00ml，置三角烧瓶中煮沸5min，并不断搅拌使之溶解。冷却到58℃时，过滤于深棕色试剂瓶中，待滤液冷至25℃时再加入10m11mol/LHCl和lg偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）或偏重亚硫酸钾(K2S2O5）充分振荡使其溶解。塞紧瓶口，用黑纸包好，置于暗处至少24h，检查染色液如透明无色即可使用。此染色液在4℃冰箱内可保存至少6个月左右。如出现沉淀，不可再用。

④SO2洗涤液：

贮存液：10%Na2S2O5（或10%K2S2O5）溶液；1mol/LHCl。

使用液：现用现配，取上述10%Na2S2O5（或10%K2S2O5)溶液5ml，加lmol/LHCl5m1,再加蒸馏水l00ml配成。

(2）试验步骤

1)蚕豆浸种催芽：

①浸种：将当年或前一年的松滋青皮豆种子按需要量放入盛有自来水（或蒸馏水）的烧杯中，置于25℃的温箱内，浸泡26-30h，此期间至少换水二次，换用的水最好事先置于25℃的温箱内预温（如室温超过25℃，即可在室温下进行浸种催芽）。

②催芽：待种子吸胀后，放置在解剖盘（或铝盒）内，用湿纱布霭盖以保持湿度，在25℃的温箱内催芽12-30h。待种子初生根露出2-3mm时，再选取发芽良好的种子，放入铺满薄层湿脱脂棉的解剖盘（或铝盒）内，仍置入25℃的温箱内继续催芽，注意保持湿度。再经36-48h，种子大部分初生根长至2-3cm，根毛发育良好，即可用于监测受试样品的诱变效应。

2)被监测受试样品液处理根尖：每一处理选取6-8粒初生根生长良好、根长一致的种子，放入盛有被测液的培养皿中，让被测液浸泡根尖即可。用自来水（或蒸馏水）处理作对照，方法相同。处理时间4-6h，视试验要求和被测液的浓度等情况而定。

3)根尖细胞恢复培养：将处理后的种子，用自来水（或蒸馏水）浸洗三次，每次2-3min。洗净后的种子再放入新铺好湿脱脂棉的解剖盘（或铝盒）内，按前述培养条件使根尖细胞恢复固定22.24h。

④固定根尖细胞：将恢复后的种子，从根尖顶端切下lcm长的幼根放入青霉素空瓶中，加卡诺氏固定液24h。固定后的幼根如不及时制片，可换入70％乙醇中，放置4℃冰箱内保存备用。

5)孚尔根（Feulgen）染色：固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗二次，每次5min。吸净蒸馏水，再加入5mol/LHCl将幼根淹没，连瓶放入28℃水浴锅中水解幼根25min左右（视根软化的程度可适当增减时间），至幼根被软化即可。用蒸馏水浸洗幼根二次，每次5min。在暗室或遮光的条件下加席夫（Schiff）试剂，每瓶用量以淹没幼根后液面高出2mm为宜。除去染液，用SO2洗涤液浸洗幼根二次，每次5min。用蒸馏水浸洗5min。将幼根放入新换的蒸馏水中，放入4℃冰箱内保存，供随时制片用。

6）制片：将幼根放在擦净的载玻片上，用解剖针截下1mm左右的根尖。滴上少许45%的乙酸溶液，用解剖针将根尖捣碎。加盖一清洁的盖玻片，注意不要有气泡。再在盖玻片上加一小块滤纸，轻轻敲打压片。

7）镜检及微核识别标准：将制片先置于显微镜低倍镜下，找到分生组织区细胞分散均匀、膨大、分裂项较多的部位，再转到高倍镜（物镜40×）下进行观察。

微核识别的标准：

①大小为主核的1/3以下，且与主核分离。

②着色与主核相当或稍浅。

③形态可为圆形、椭圆形、不规则形。

每一处理观察三个根尖，每个根尖计数1000个细胞中的微核数。

4．质量保证与质量控制

①对严重污染的水环境，监测时可能造成根尖死亡，应稀释后再作测试。

②在没有空调等恒温设备的条件下，如室温超过35℃。微核率本底可能有升高现象，但可采用污染指数法评价，不会影响监测结果。

5．数据与报告

（1)数据处理

将微核观察记载表上所得数据，按如下步骤进行统计学处理。

①按以下公式计算各测试样品（包括对照组）的微核千分率（MCN%o):

MCN‰=某测试样点（或对照）观察到的MCN数/某测试样点（或对照）观察的细胞数×1000‰

②如果受试样品不多，可直接用各样品MCN率平均值与对照比较（(t检验），从差异的显著性判断水质污染与否。

③如果受试样品较多，可先用方差分析（F检验）看各采样点（或各样品）所出现的MCN率平均值和对照的差异显著性。如差异显著，还可进行各采样点微核差异显著性的多重比较，看受试样品MCN率平均值差异的分组情况，以归纳划分这些不同采样点不同级别的污染程度。

④如采用已筛选出的、又专门隔离栽培、无污染的松滋青皮豆作供试材料，并按规范实验条件（其对照本底MCN‰为l0‰以下），受试样品污染程度的划分，可不用上述两种统计处理方法，直接采用（2)①的评价标准进行评价。

(2）结果评价

凡数值在上、下限值时，定为上一级污染。

①"MCN%”判别：当符合（1)④时，可利用MCN‰按如下标准直接评价：

MCN%在10‰以下为基本没有污染；10‰-18‰区间为轻污染；18‰-30‰区间为中污染；30‰以上为重污染。

②“污染指数”判别：此方法可避免因实验条件等因素带来的MCN%本底的波动。

污染指数（PI)＝样品实测MCN‰平均值/标准水（对照组）MCN‰平均值

污染指数在0-1.5区间为基本没有污染；1.5-2区间为轻污染；2-3.5区间为中污染；3.5以上为重污染。

(3）结果报告

①受试物：名称、来源、采样时间、地点等。

②浓度：受试物的处理浓度或稀释浓度（以体积％计）。

③各处理组的MCN‰、统计分析方法及结果。

④结论：对于受试物为化学品或污染物等物质，报告其蚕豆根尖微核率显著性情况，评价其安全性；对于受试物为环境水样或污水，报告其污染程度。