微囊藻毒素是最常见的一类蓝藻毒素。水体中的产毒藻类和藻类毒素因其多样性而必须建立和运用不同的方法，但是，微囊藻毒素的检测无论如何都是对淡水和废水中的藻毒素进行监测的重要任务之一。

水中微囊藻毒素（Microcystin/MC/MCYST）的含量极微，一般在1μg/L以下。对它的检测技术，经典可靠的方法是生物检测法（Bioassay)，但因其灵敏度较低（mg/ml级水平）、不能用于水样检验。目前常用酶联免疫吸附法（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)，灵敏度可达ng/L水平；蛋白磷酸酶抑制法（ProteinPhosphotaseInhibitionAssay),灵敏度在99/L左右；高效液相色谱法（HPLC)。ELISA方法需要制备MC的完全抗原及其抗体，目前国内仍无法供应；它只能测定总的MC量，无法将不同的MC分开。蛋白磷酸酶抑制法常与放射性32P或荧光剂结合使用，增加了测定操作和设备；藻细胞内源磷酸酶的存在，也增加了测定误差。此外，它也和ELISA方法一样，只能测定总的MC量。HPLC法有较高的灵敏度和精密度，一次能测定多种MC，高效液相色谱仪在我国亦逐步普及。目前，虽然国际上还没有一个公认的标准方法，但用该法检测水中的MC是切实可行的。根据Tsugi等和中科院水生所做的结果，高效液相色谱法可测到0.02μg/L的MC。

1．样品的采集与保存及处理

用采水器取1-5L待测水样，先用25号浮游生物网过滤，以除去水样中的浮游生物，然后于杯式滤器中经0.45μm的滤膜减压过滤。滤液加10ml甲醇混匀后过C18反相固相萃取柱（(500mg/6ml)。Cl8反相固相萃取柱预先用10ml甲醇活化，再以20m1的二次蒸馏水调整。将水样以5-10ml/min流过固相萃取柱进行富集浓缩。然后用10ml5％的甲醇水溶液淋洗以净化样品，待固相萃取柱吹干后，以4m1甲醇将微囊藻毒素洗脱并经针头过滤器后收集于浓缩瓶内。洗脱液用旋转蒸发器蒸发干燥后于-20℃冷冻保存。分析前用甲醇溶解，定容至0.10ml，进样量10μl。

采集待测水样（(1000m1)，立即加乙酸至5％固定，置于-20℃冰箱避光存放。

2．仪器设备

①高效液相色谱仪，具紫外检测器。

②真空抽滤器。

③C18反相固相萃取柱。

④硅胶柱：SiOH正相硅胶柱。

⑤旋转蒸发器。

⑥微量注射器。

⑦注射器：气密性注射器。

3．受试生物种或材料

①水样，微囊藻等。

②HPLC用流动相的配制：

甲醇：磷酸缓冲液＝6：4。

③磷酸缓冲液的配制（以4L为例）：准确称取27.22gKH2PO4(0.2mol),溶解于4L去离子水中（先将KH2PO4加入装有200ml去离子水的500m1烧杯中加热溶解后，再定容至4L)。后用20％的磷酸调整pH至3.0(pH调过量可用KOH再调整）)。配好后，置于大试剂瓶中，避光存放。

④甲醇：色谱纯。

⑤藻毒素标准样品：MC-RR,MC-YR,MC-LR。

4．试验程序

(1)水样中微囊藻毒素待测样品的制备

此洗脱下来的MC溶液，用旋转蒸发器蒸干，加入适量（通常是0.4-0.5ml）的HPLC流动相定容，即可在HPLC中测定。对照MC的标准物，可确定MC的种类、数量。

(2)MC的提取

根据上述样品制备程序提取MC。

硅胶柱活化：拔下注射器塞，将柱装于注射器头上，注入约10ml甲醇，使之缓缓过柱。完成后，取下柱子，再注入约15m1蒸馏水清洗柱，活化即完成。一个活化柱用于一个样品。

固相萃取：将水样通过己活化的C18固相萃取柱，然后用约15ml20％甲醇洗脱C18固

相萃取柱，除去部分极性的杂质，再用甲醇洗脱C18固相萃取柱，柱上的毒素、色素等非极性物质被洗脱，收集洗脱液。

(3）毒素的净化

硅胶柱的活化：用l0ml甲醇缓缓过柱，并用蒸馏水清洗硅胶柱二次。

净化：将上述甲醇洗脱液过硅胶柱，用8-10m1甲醇洗脱非极性的杂质，再用l0ml三氟乙酸（TFA）的甲醇溶液（含10%H2O、0.1％三氟乙酸）将毒素洗脱。收集洗脱液。

(4）毒素定容
将上述洗液收集于充分干燥的梨形瓶中。将过柱后的上清液再次过柱，洗脱液洗脱二次，洗脱液并入梨形瓶中，在旋转蒸发器上蒸干。
梨形瓶充分蒸干后，用lml移液器吸取0.9ml甲醇充分洗涤梨形瓶，使粗毒素溶解，再转入离心管中，然后用移液器吸取0.6ml蒸馏水充分润洗梨形瓶，洗液并入离心管中。封好离心管，充分摇匀后，用移液器转入注射器中（注射器预先装上过滤头），收集约0.8ml滤液于另一离心管中用于测定。

注：①甲醇有毒，使用时须小心，尽量不使接触皮肤，实验过程中房间尽量通风。

②所使用的容器，如梨形瓶、注射器等均需认真清洗并充分干燥。

5．测定

（1）测定

HPLC的流速为1ml/min。检测波长为238nm。流动相：pH3的磷酸盐缓冲液和甲醇。经与标样比较便可以得到三种微囊藻毒素的含量。

将上述制备的样品用微过滤器过滤后，HPLC检测。

色谱条件：检测波长：238nm；色谱柱：Shim-packCLC-ODS反相柱0.15m×6.0mm;
柱温：40℃。流动相：甲醇：磷酸缓冲液＝6：4，脱气处理。流动相流速：lml/min;

注：可将甲醇和磷酸缓冲液分开用两个试剂瓶存放，双泵按照6：4的比例分别进甲醇和磷酸缓冲液。

(2）进样

用微量注射器准确称取一定量的试样（(1-5111)，迅速注入高效色谱仪后，立即拔出注射器。

6．质量保证和控制

实验中主要是注意干扰物质的影响，干扰物质可能通过下列途径进入，即水体中存在、
采样器引入、固相萃取柱引入和溶剂引入。对于水体中的干扰物质主要是通过反相填料的选择性吸附后，利用不同极性的淋洗液将其去除；微囊藻毒素从SEP柱上洗脱时其洗脱条件也要优化，而且必须对SPE柱进行清洗；还要选择合适的洗脱液，90％或100％的甲醇可以达到较好的结果。

7．计算

根据下式计算出毒素含量。

C＝E.A.V1/AE•V2

式中：C一—水样中毒素的浓度(μg/L）；

E——标样中毒素的浓度(μg/L);

A——水样测得毒素的峰面积；

AE——标样测得毒素的峰面积；

V1——试样体积（ml)，本法为1.5ml;

V2——水样体积（ml)。