紫露草微核试验（Tradescantia-micronucleu-test）是1978年由美国马德修教授创立的致突变物检测方法，该检测方法已得到国际公认。由于紫露草微核试验具有快速（监测结果可在24h至48h内得出）、简便、经济、有效等优点，已在地表水、地下水、饮用水源水、饮用水、工业废水、海水、大气、土壤、农药、食品、食品添加剂、放射性污染监测等方面得到了广泛应用。

1.原理

生物细胞中的染色体在复制过程中常会发生一些断裂，在正常情况下，这些断裂绝大多数能自己愈合。如果生物细胞在早期减数分裂过程中受到辐射或环境中其他诱变因子的作用而引起的染色体断片，由于缺少了着丝点而不能受纺锤丝索动移到细胞两极而游离在细胞质中，当新细胞形成时，这些断片就形成了大小不等的微核，分布在主核的周围。紫露草微核技术选用了对辐射和诱变反应十分敏感、花粉母细胞在减数分裂时具有高度的同步性、自然本底微核率较低（一般为5%-9%)、微核形成过程较短的美国沼泽紫露草3号（Tradescantiapaludosa#03)作为试验材料，把在减数分裂过程中花粉母细胞的染色体作为诱变因子的攻击目标，将早期四分体中形成的微核作为观察终点，把从大量早期四分体中得到的微核率作为染色体受到损伤的指标，进而评价环境中致突变物对真核生物细胞中染色体的损伤程度。

2．水样的采集与保存
用于微核试验的水样如不能及时进行检测，应置于约4℃的冰箱中保存。

3．主要器材和试剂

（1)主要器材

①显微镜、载玻片、盖玻片、手术剪、解剖针、解剖刀、镊子、酒精灯等。载玻片和
盖玻片一定要清洁。

②人工光源：日光灯架，架高约50cm，光源为两支并列的40W日光灯。

③无毒塑料薄膜或直径为10cm左右的带孔薄塑料板。

④血球分类计数器。

⑤曝气鱼泵（供充氧用）。

⑥温度计。

⑦电冰箱。

(2）试剂

①卡诺氏液：由三份无水乙醇和一份冰乙酸混合而成，固定液现用现配。

②70％乙醇。

③lmol/LHCl。

④lmol/LNaOH。

⑤1％乙酸洋红：将50m145％冰乙酸水溶液盛入150m1三角瓶中，徐徐投入0.5g洋红粉末，文火煮沸1-2h。为增加染色效果，可在溶液中悬一小铁钉煮几分钟，使染色液含少许铁离子，或待溶液冷却后加入1-2滴乙酸铁溶液，将过滤后的染色液装于棕色滴瓶中备用。

⑥二甲基亚砜(DMSO)。

4．受试生物材料
美国沼泽紫露草3号。它对辐射和诱变反应十分敏感，花粉母细胞在减数分裂时高度同步，自然本底微核率较低（一般为5%-9%)，微核形成过程时间较短，栽培方便，取材容易（在适宜的生长条件下，可全年开花）。通过营养繁殖和复壮，可保证品种的同一性。

紫露草的栽培与管理见附件。

5．试验步骤

（1)选择花序

按每个处理组至少15个花序计算，随机采摘一定数量的紫露草花枝，每个花枝应有10个以上的花蕾，顶端开第一朵花，花枝带有两片叶子，花枝长6-8cm。暂插入盛有自来水的容器中备用。

(2)调整酸碱度（pH)

用1mol/LHCl或lmol/LNaOH溶液调节水样的pH至5.5-8.5。

(3）处理

将过滤后的水样分别盛入已编号的500ml烧杯中。烧杯上加盖带孔的塑料薄膜或薄塑料板，每个处理组和对照组各插入15个花枝。用蒸馏水或自来水作阴性对照，在人工光源下连续处理6h。每个水样应做平行试验。由于紫露草只能检测水溶性的诱变剂，因此，欲检测非水溶性诱变剂，可先用二甲基亚砜溶解，经自来水稀释后再进行试验，同时做二甲基亚砜的空白试验。如果水样污染物浓度较高，可用自来水作适当稀释；如果水样是海水，可用自来水稀释50％后再进行处理。水源水、生活饮用水或污染物浓度较低的水样，可适当延长处理时间。

(4）恢复培养

将水样倒掉，用自来水将处理组紫露草花梗冲洗干净，再在烧杯中换上自来水，在人工光照下做连续24^-30h的恢复培养。

(5）固定及保存

将恢复培养后的花枝，去掉叶子和花梗，把花序放入新配制的卡诺氏液中固定24h,再将花序移入70％乙醇中，即可制片观察。也可将固定后的花序置4℃左右冰箱中长期保存，但每月需更换70％乙醇一次。

(6）压片及微核观察

取出一个固定好的花序，置干净的玻璃板上（15cm×15cm)，用解剖刀把花序从中纵剖成两部分。选择一个适龄的花蕾（一般在中下部），用解剖针或尖镊子刺破花蕾，剥出花药，滴一滴乙酸洋红，并稍加压挤，置100倍显微镜下观察。若绝大部分是早期四分体，则充分捣碎花药，让更多的四分体释放出来，弃去载玻片上的杂质，小心盖上盖玻片，置酒精灯火焰上来回微热3-4次，然后把玻片放在清洁的吸水纸下，用手轻压盖玻片，使四分体分散，并将载玻片置显微镜下观察计数。如果染色过深，可在盖玻片的一端滴一二滴45％冰乙酸，然后用一条吸水纸在另一端将冰乙酸吸引过去，稍加褪色；如果染色过浅，可在盖玻片的一端再滴一滴乙酸洋红。

将制好的片子置400倍显微镜下镜检。从玻片的一端逐渐移到另一端，随机计数四分体数和微核数，每张片子至少观察300个四分体，分别统计出含有一、二、三……个微核和无微核的四分体数，将观察结果填入表5-4-8中。每个处理组和对照组至少观察五张片子。

镜检片可用石蜡一蜂蜡混合剂（石蜡二份和蜂蜡一份融成）将盖片四周封住，置4℃左右冰箱中短期保存。欲长期保存，可做成永久制片。

6．质量控制

1)供试紫露草花序应生长良好且无病虫害，本底微核率应小于10%。

2）采集的水样应及时检测，否则应将水样置4℃左右冰箱中保存。检测时应提前将水样从冰箱中取出，待水温升至室温后方可进行试验。

3）供作阴性对照和稀释用的自来水与充氧蒸馏水微核率应无显著性差异，否则采用充氧蒸馏水作阴性对照。

4）严格选择处于早期四分体时期的花蕾压片是试验成功的关键。早期四分体的直径为18-22μm，外具一层不易破裂的包膜，细胞核大而明显（照片5-4-1，左）。适龄花蕾通常出现在第七对或第八对花蕾中，一个花序最多只有一个花蕾处于早期四分体时期，这种含有早期四分体的适龄花蕾在花序中存在的几率一般为30%-50%。
一个早期四分体中的微核从无到数个不等。微核的直径为0.5-3μm，呈圆形或椭圆形（照片5-4-1中），分布在主核周围，着色与主核一致。下述情况的微核不应统计：

①四分体以外的微核；

②由于分裂延缓所造成的特别大的四分体中的微核；

③死亡四分体中的微核（照片5-4-1，右）；

④雄蕊毛、花药壁及花丝细胞中的微核。

(5）如果同一试验组的平行试验，平均微核率相差2％以上，应重做试验。

7．微核统计及污染判断

根据统计学需要，每个处理组和对照组至少要镜检五张片子。每张片子至少统计300个四分体，分别将每个处理组和对照组1500个四分体中的微核数全部加起来，求出平均微核率。

平均微核率=微核总数/四分体总数×100%

再分别求出每个处理组和对照组的标准偏差和标准误差，用下述平均值差的标准误差公式进行比较：

Sd=√(SE_t)²＋(SE_c)²

式中：Sd——平均值差的标准误差值；

SE_t——处理组的标准误差值；

SE_c——对照组的标准误差值。

当平均值等于或大于平均值差的标准误差两倍时，表示处理组与对照组平均微核率差异显著（p<0.05)，说明处理组已受到诱变剂污染。

8．照片

附件

紫露草的栽培与管理

紫露草（Tradescantiapaludosa）又名沼泽紫露草，系鸭跖草科（Commelinaceae）紫鸭跖草属(Tradescantia）多年生草本植物。紫露草植株直立，叶线形。花瓣3，蓝紫色，辐射对称。两性花，雄芯6，稀5。子房3室，每室有2胚珠。聚伞状花序，茹果开裂。染色体2n=12。供检测用的材料，采用从美国引种的紫露草3号（Tradescantiapaludosa#03)。

紫露草是温带长日照植物，宜在温暖、湿润、肥沃、有机质丰富的土壤中生长。生长的最适温度白天为21-26℃，夜间为16℃左右。最适的空气相对湿度为60%-80%，每天要求16-18h日照。如果条件适宜可全年开花，光照不足开花数量少，且不整齐。如果要在日照较短的季节中现蕾开花，需在20-22℃恒温室增加照度为18001x的人工光源，每天光照16h左右。
紫露草盆栽、地栽均可，最好是地栽。栽培地应避免工业“三废”、农药和放射性物质污染。在栽培管理中施发酵粪肥和饼肥为好，少施化肥；每盆紫露草不宜栽得过多，通常一个直径为16cm的花盆栽15株左右；要适时对紫露草进行整枝，初花和开过的花要及时摘掉；为了保持紫露草遗传性状的稳定性和对诱变剂的敏感性，应采用无性繁殖，不用种子繁殖，每隔1年至2年采用扦插方式进行复壮更新，扦插最好在春季或秋季进行。紫露草对病虫害的抵抗能力较强，很少发生病虫害。由于地栽紫露草面积不大，盆栽紫露草数量不多，一但有病虫害发生，可采取人工拔除和人工捕杀，拔除的病株应就地烧毁。禁施农药和除草剂。为了解决紫露草在城市栽培的用地、光照等问题，紫露草可进行屋顶栽培。紫露草是温带长日照植物，喜温暖，长江以南的地方一般可在室外自然越冬。在北方或海拔较高的地方，冬季应将紫露草移入温室或在塑料棚内。