除非检测某个已知的特定蛋白，否则尽量不要用严格的免疫沉淀条件或减少免疫沉淀产物的洗涤次数。此外，要尽量避免在加人蛋白A/G-Sepharose悬浊液时，稀释细胞抽提物。也就是不要用太大体积的免疫沉淀缓冲液冲洗蛋白A/G-Sepharose。当进行免疫共沉淀实验时，需要从两个方向分别进行共沉淀。即用A蛋白的抗体进行免疫共沉淀，用B蛋白的抗体进行免疫检测；再用B蛋白的抗体进行免疫沉淀，用A蛋白的抗体进行免疫检测。这种做法可提高二者相互作用的真实性。然而，在很多情况下，只能从一个方向进行成功的免疫共沉淀。这种现象的出现可由很多因素造成，包括由于蛋白结合抗体或其他亲合试剂阻断了同另一种蛋白的结合，或者由于蛋白结合比例的差别造成。例如，A蛋白可能与B蛋白之外的其他蛋白结合较多，而B蛋白可结合大量的A蛋白。在这种情况下，检测这种相互作用最好使用B蛋白来沉淀。

另外，使用免疫共沉淀来检测目标蛋白时，提高其表达量是十分必要的。通常免疫共沉淀的适宜蛋白量是有一定范围的，蛋白表达量太高会导致不可控制的相互作用。当一种蛋白在细胞内源性表达很低时，可以通过大量表达标签标记的蛋白，再通过一定的方法浓缩，使蛋白浓度增大。

事项说明：

(1) 加入微量试剂时，很小的体积误差可能会导致结果发生很大的变化。所以同时沉淀多个样品时，可用免疫沉淀缓冲液稀释抗体，以确保分配到每一样品中的抗体量较为一致。

(2）当免疫沉淀物用于酶活性检测时，这一步可用于降低非特异性背景。如果背景不成问题，这一步可跳过。

(3) 温和地颠倒混匀样品，而不是强烈振荡混匀。为增加抗原抗体复合物与免疫磁珠（bead）的结合，冰浴时间可延长至几小时。考虑到样品蛋白有被水解的可能，时间的延长需适当。

(4）保存上清液用于评价目标蛋白免疫沉淀的效率。

(5）这一步可根据抗原抗体复合物的亲和力大小，改变洗涤条件的严格性。严格的洗涤条件包括增加盐浓度和增加洗涤次数。样品在进行SDS-PAGE分离之前，需要用不含NaCl的裂解液洗最后一次。

免疫沉淀最重要的一个目标是获得信噪比低，背景干净的结果。在实际应用中，改变某些参数可提高免疫沉淀的成功率。其中之一是优化免疫沉淀的抗体。蛋白A/G琼脂糖的使用虽然能得到可靠的结果，但是，直接将抗体和琼脂糖相连可降低背景，从而提高免疫沉淀的质量。此外，抗体与细胞抽提物的比例在很大程度上影响了结果的好坏。

如果免疫沉淀有交叉反应，需要用亲和层析来纯化抗体。此外，还有一些降低背景的方法。首先，可在免疫沉淀和洗涤的过程中增加盐和去污剂的浓度来降低非特异性结合；其次，可增加洗涤的次数，但是这种方法有可能同时减少相互作用的特异结合蛋白；第三，细胞抽提物可与蛋白A/G - Sepharose进行预先孵育，这样可去除与固相成分结合的非特异蛋白；第四，裂解液和免疫沉淀缓冲液中都可加入1％牛血清白蛋白（BSA）来减少非特异结合。最后，提高细胞抽提物中目标蛋白的含量或表达量，也可加强信号的强度。例如，已知目标蛋白是核蛋白，我们可通过制备核抽提物（取代全细胞抽提物的制备），增加该蛋白的相对含量，然后再进行免疫沉淀。净化细胞抽提物的一个较好方法是在100 000g的高转速下离心，所得的样品可直接用于免疫共沉淀而不必经过冷却的步骤，这样可提高蛋白免疫沉淀的效能。