（1）再水化加样

1) 将水化后的IPG胶条从再泡胀盘上移出。

2）将水化后的IPG胶条转人到干胶条托盘上排列盘的相邻槽中，使胶条的尖（酸性）端位于托盘上端接近红色的电极处。平端应当位于托盘的另一端，接近负极端。对准IPG胶条，使正极的凝胶边缘成一条线。

3) 放置潮湿的电极纸带，使电极纸带横贯已对齐的胶条的正极和负极两端，电极纸带必须与各IPG胶条的表面部分接触。

4）安装电极。每个电极在边上标有正负极，在电极纸带上调准各电极，确保电极标注一侧对着托盘上提供电极接触的一侧。当电极正确调整后，向下压低电极，使电极与电极纸带接触，检查IPG胶条确保在各自的槽中对齐。

(2）样品杯加样若在干胶条再水化过程中没加样，那么在进行电泳前，可以利用样品杯进行加样。根据蛋白样品和所使用染色方法灵敏性不同，来决定加样量的多少。

1) 准备样品：在与再水化液具有相同成分的溶液中准备样品。

2）确定加样点：选择最佳的加样点依赖于样品的特性，当感兴趣的蛋白质具有偏酸性的PI或在样品预处理过程中使用了SDS，建议在接近负极处设立加样点。带正电的样品进行加样时，最好使用pH3-10的梯度。由于样品的自然属性不同，最佳的加样点也可能各不相同。

3) 放置样品杯架：将样品杯放置在样品杯架上，应放在样品杯架足够高的位置以避免接触凝胶表面。依据样品调整样品杯架的位置，使样品杯距负极或正极几毫米远。样品杯必须对着电极。样品杯架的一侧有一块垫片，向正极或负极移动样品杯架，直至垫片正好接触负极或正极。

4）移动样品杯至指定位置，使各IPG胶条上方各有一个样品杯，下压样品杯，使样品杯与胶条接触良好。检查胶条是否位于正确位置上，与干胶条排列盘对齐。

5）当样品杯正确安装完毕后，在托盘上加入70-80ml的IPG覆盖液，使胶条完全被覆盖液覆盖。若IPG覆盖液渗透到样品杯内，应调准样品杯的位置，用吸管吸去杯内的覆盖液，并检查是否依然有渗漏。另加入大约150m1的IPG覆盖液，使样品杯覆盖。IPG胶条浸没在一层IPG覆盖液下，可以防止IPG胶条变干、再水化液成分的沉淀以及防止空气溶入IPG胶条。

6）加样：利用微量移液器在IPG覆盖液面下加样（每条IPG胶条可加多达100μl的样品），所加样品应当沉入样品杯的底部，观察样品是否从样品杯中渗出。通过样品杯加样时，加样点上有可能形成沉淀，这样加入的蛋白量有可能比在再水化液中加的蛋白量要少。

(3）聚焦

1) 聚焦条件，请参照表16.2：

2）等电聚焦后，应立即进行第二向电泳，或将IPG胶条放在具有螺纹盖的试管内，-70℃条件下保存。