IPG干胶条在进行IEF前必须再水化。最佳再水化液的选择依赖于样品中特定蛋白溶解性的要求。

(1) 水化液组成一般的再水化液含有尿素、非离子或兼性去污剂、DTT、 Pharmalytes或IPG缓冲液，其pH应适合于IPG干胶条pH范围和染料pH。

尿素（Urea)：使蛋白质溶解和变性，展开蛋白质分子，使它们的内部带电氨基酸残基暴露。通常使用浓度为8mol/L，但为了蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到9或9. 8mol/L。最近有报道，除了使用尿素外，使用硫脉能进一步改善蛋白质的溶解性。

去污剂（detergent)：促进疏水蛋白质溶解并减少蛋白质分子间的结合。去污剂分子必须带电量为零，只能使用非离子或兼性去污剂，一般常用CHAPS、TritonX-100或NP-40，使用浓度为0.5％-4%。

还原剂（reductant )：破坏二硫键使蛋白质完全展开，通常使用DTT或DTE (20-100mmo1/L )。也可使用2-巯基乙醇替代，但需要更高的浓度并且杂质会产生干扰。非硫还原剂磷酸三丁醇酯( tributylphosphine, TBP )因为溶解性差以及在再水化液中不稳定，所以不推荐作等电聚焦的还原剂。

IPG缓冲液和／或Pharmalyte（载体两性电解质混合物）：能提高分离效果和样品溶解度，尤其是在加样量多时。载体两性电解质的混合物在等电聚焦过程中不影响梯度，还能促进样品的溶解度，使等电聚焦过程中，在整个梯度范围内能产生更一致的导电性。IPG缓冲液不影响银染效果，但要选择与再水化干胶条pH梯度一致的IPG缓冲液。提高IPG缓冲液／Pharmalyte浓度可以提高样品溶解性，并提高对样品中盐的耐受，使胶条导电性更加一致。但高浓度IPG缓冲液会限制电压升高，增加聚焦时间；银染时，需要延长固定时间洗去两性电解质，以避免增加染色背景；缓冲液浓度在建议浓度的上限时，在IEF过程中有可能增加使电压达到设置最大值时所需的时间，从而增加完全聚焦所需的时间。IPG缓冲液可以预先加入水化液中储存，也可在使用前再加入。当使用多条具有相同pH范围的IPG胶条时，IPG缓冲液可与再水化液一起储存。当用同种分装储存的再水化液来处理不同pH范围的IPG干胶条时，在使用前将不同IPG缓冲液分别加入到单份储存液中。

指示染料（tracking dye)（溴酚蓝）：指示从开始进行电泳时，等电聚焦（IEF）的进程。若指示染料没有向正极移动，说明没有电流移动。

样品（sample)：样品能通过加在再水化液中进行加样。在等电聚焦前每条胶条上多达 lmg的蛋白样品能稀释到或溶到再水化液中。放射性标记所需的样品量较少，银染一般需要100μg的总蛋白样品，考马斯亮蓝染色和制备加样则需要更多的蛋白样品。

经典的再水化液组成：8mol/L尿素、0. 5% (W/V) CHAPS、0. 2% (W/V) DTI、0. 5% IPG缓冲液或Pharmalyte和0.002%溴酚蓝。

(2）再水化步骤

1) 再泡胀盘的准备：Immobiline干胶条再泡胀盘具有12个独立的槽。每个槽都能容纳最长达24cm的单根IPG胶条。相互分开的槽能减少每条IPG胶条的再水化液体积。从盘上完全抽出保护盖，通过旋转调平脚使泡胀盘水平，直至气泡位于水平仪的中间，确保托盘的干净和干燥。

2）加入再水化液：将适量的再水化液用吸管加入到各槽中（表16.1)。将溶液加入到槽中间，去除气泡。要确保所有溶液（包括样品）被吸收，不要加入过量的再水化液。

3) 放置IPG干胶条：从IPG干胶条酸性（尖）端除去保护膜，并且使胶条尖端靠着盘突起的一端；使胶条胶面朝下贴近溶液。为了使胶条被溶液浸润，应慢慢的抬高或放低胶条并且来回的沿着液体表面滑动。注意不要使IPG胶条底部产生气泡。在每一根IPG胶条上铺上一层IPG覆盖液，以减少蒸发和尿素结晶。盖上盖子使IPG干胶条在室温再水化。进行水化至少需要10小时，建议在晚上进行过夜再水化。水化过程中，IPG胶条碱性端往往比酸性端膨化速度快。若IPG胶条膨胀不均匀，其可能的原因是：①干的IPG胶条在室温或在高于室温的条件下储藏太久。不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟，胶条会从空气中吸收水分，应将IPG胶条密封好并在-20℃以下温度保存；②再水化液的使用体积不正确；③再水化时间太短，应至少10小时。