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本方法虽然快速,但可能不如其他方法灵敏,尤其对小分子质量的蛋白质。
材料:
含有目的蛋白的聚丙烯酰胺凝胶
50% (V/V)甲醇/12% (V/V)乙酸
95% (V/V)乙醇(可选)
甲醛固定液
0.02%(W/V)硫代硫酸钠
0. 1 % (W/V)硝酸银
硫代硫酸盐显影液
50%(V/V)甲醇
带盖的玻璃或塑料容器,大小适合于盛放凝胶
台式摇床
1) 可选:为了阻止蛋白质扩散和改善背景,将凝胶在50%甲醇/12%乙酸中固定1-12h,在95%乙醇中洗涤凝胶3次,每次20 min。
2)将凝胶置于含有3倍凝胶体积甲醛固定液的塑料或玻璃容器中,1 mm厚的凝胶在摇床上摇动15 min; 1. 5 mm厚的凝胶摇动30 min。
3)倒出固定液,加入5-10倍凝胶体积的水,摇动S min。重复2次。
4)将水弃去,加入3倍凝胶体积的0.02%硫代硫酸钠,摇动1 min。
5)倒出硫代硫酸钠,加入5-10倍凝胶体积的水,摇动1 min。重复2次。
6)将水倒掉,加入3倍凝胶体积的0.1%硝酸银,摇动10 min。
7)除去硝酸银,加入5-10凝胶体积的水,摇动1 min。重复2次。
8) 将水倒掉,加入几毫升硫代硫酸盐显影液,直到棕色沉淀形成(30秒)。弃去显影液,加入3倍凝胶体积新的硫代硫酸盐显影液,刚好在条带达到合适的强度之前,迅速用水洗涤凝胶,以除去过量的硫代硫酸(避免背景染色)。
9)加入50%甲醇/12%乙酸,摇10 min,终止反应。
10)为了防止过一段时间后蛋白质条带加深,在摇动同时,用5-10倍凝胶体积的50%甲醇洗涤凝胶30 min。重复1次。
11) 将凝胶置于可重复密封的塑料袋中,4℃保存;要长久记录,将凝胶扫描或照相;或干燥。
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