一、原理

取干燥试样，经α一淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖昔酶酶解消化，去除蛋白质和淀粉，酶解后样液用乙醇沉淀、过滤，残渣用乙醇和丙酮洗涤，干燥后物质称重即为总膳食纤维（total dietary fiber,TDF）残渣；另取试样经上述三种酶酶解后直接过滤，残渣用热水洗涤，经干燥后称重，即得不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber,IDF)残渣；滤液用4倍体积的95％乙醇沉淀、过滤、干燥后称重，得可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber,SDF）残渣。以上所得残渣干燥称重后，分别测定蛋白质和灰分。总膳食纤维（TDF)、不溶性膳食纤维（IDF)和可溶性膳食纤维（SDF）的残渣扣除蛋白质、灰分和空白即可计算出试样中总的、不溶性和可溶性膳食纤维的含量。

二、试剂

除特殊说明外，本标准中实验室用水为二级水，电导率（25℃)≤0.10mS/m，试剂为分析纯。

（1)95％乙醇（CH3CH2OH)：分析纯。

85％乙醇溶液（CH3CH2OH)：取895mL95％乙醇置1L容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。

78％乙醇溶液（CH3CHZOH)：取821mL95％乙醇置1L容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。

(2）热稳定。一淀粉酶溶液：于0一5℃冰箱储存，酶的活性测定及判定标准见补充内容。

(3）蛋白酶：用MES一TRIS缓冲液（a)配成浓度为50mg/mL的蛋白酶溶液，现用现配，于0一5℃储存。

(4）淀粉葡萄糖昔酶溶液：于0一5℃储存。

(5)酸洗硅藻土：取200g硅藻土于600mL的2mol/L盐酸中，浸泡过夜，过滤，用蒸馏水洗至滤液为中性，置于525℃±5℃马福炉中灼烧灰分后备用。

(6）重铬酸钾洗液：100g重铬酸钾（K2Cr2O7)，用200mL蒸馏水溶解，加入1800mL浓硫酸混合。

(7)MES：2一（N一吗啉代）乙烷磺酸（C6H13NO4S-H2O)。

(8)TRIS：三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3)。

(9)0.05mol/L MES一TRIS缓冲液；称取19.52gMES和12.2gTRIS，用1.7L蒸馏水溶解，用6mol/L氢氧化钠调pH值至8.2，加水稀释至2L。

注：一定要根据温度调pH值，24℃时调pH值为8.2;20℃时调pH值为8.3；

28℃时调pH值为8.1;20℃和28℃之间的偏差，用内插法校正。

（10)3mol/L乙酸（HAC）溶液：取172mL乙酸，加入700mL水，混匀后用水定容至1L。

(11)0.4g/L溴甲酚绿（C21H14O5Br4S)溶液：称取0.1g澳甲酚绿于研钵中，加1.4mL0.1mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。

（12）石油醚：沸程30一60℃。

（13）丙酮（CH3COCH3）。

三、仪器

(1)高型无导流口烧杯：400mL或600mL。

(2)坩埚：具粗面烧结玻璃板，孔径40一60lim（国产型号为G2坩埚）。坩埚预处理：坩埚在马福炉中525℃灰化6h,炉温降至130℃以下取出，于洗液中室温浸泡2h，分别用水和蒸馏水冲洗干净，最后用15mL丙酮冲洗后风干。加入约1.0g硅藻土，130℃烘至恒重。取出坩埚，在干燥器中冷却约1h，称重，记录坩埚加硅藻土质量，精确到0.1mg。

(3）真空装置：真空泵或有调节装置的抽吸器。

(4）振荡水浴：有自动“计时一停止”功能的计时器，控温范围（60±2)℃~(98±2)℃。

(5)分析天平：灵敏度为0.1mg。

(6）马福炉：能控温525℃±5℃。

(7）烘箱：105℃,130℃±3℃。

(8)干燥器：二氧化硅或同等的干燥剂。干燥剂每两周130℃烘干过夜一次。

(9)pH计：具有温度补偿功能，用pH值为4.0、7.0和10.0标准缓冲液校正。

四、分析步骤

1.样品制备

样品处理时若脂肪含量未知，膳食纤维测定前应先脱脂，脱脂步骤见（3)。

(1)将样品混匀后，70℃真空干燥过夜，然后置干燥器中冷却，干样粉碎后过0.3一0.5mm筛。

(2）若样品不能受热，则采取冷冻干燥后再粉碎过筛。

(3）若样品中脂肪含量>10%，正常的粉碎困难，可用石油醚脱脂，每次每克试样用25mL石油醚，连续3次，然后再干燥粉碎。要记录由石油醚造成的试样损失，最后在计算膳食纤维含量时进行校正。

(4）若样品糖含量高，测定前要先进行脱糖处理。按每克试样加85％乙醇10mL处理样品2一3次，40℃下干燥过夜。
粉碎过筛后的干样存放于干燥器中待测。

2.试样酶解

每次分析试样要同时做2个试剂空白。

(1)准确称取双份样品（ml和m2)1.0000g±0.0020g，把称好的试样置于400mL或600mL高脚烧杯中，加入pH=8.2的MES一TRIS缓冲液40mL，用磁力搅拌直至试样完全分散在缓冲液中（避免形成团块，试样和酶不能充分接触）。

(2）热稳定a一淀粉酶酶解：加50μL热稳定a一淀粉酶溶液缓慢搅拌，然后用铝箔将烧杯盖住，置于95一100℃的恒温振荡水浴中持续振摇，当温度升至95℃开始计时，通常总反应时间35min。

(3)冷却：将烧杯从水浴中移出，冷却至60℃，打开铝箔盖，用刮勺将烧杯内壁的环状物以及烧杯底部的胶状物刮下，用10mL蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。

(4）蛋白酶酶解：在每个烧杯中各加入（50mg/mL)蛋白酶溶液100μL，盖上铝箔，继续水浴振摇，水温达60℃时开始计时，在60℃±1℃条件下反应30min。

(5)pH值测定：30min后，打开铝箔盖，边搅拌边加入3mol/L乙酸溶液5mL,溶液60℃时，调pH值约为4.5(以0.4g/L溴甲酚绿为外指示剂）。

注：一定要在60℃时调pH值，温度低于60℃pH值升高。每次都要检测空白的pH值，若所测值超出要求范围，同时也要检查酶解液的pH值是否合适。

(6)淀粉葡萄糖昔酶酶解：边搅拌边加入100μL淀粉葡萄糖昔酶溶液，盖上铝箔，持续振摇，水温到60℃时开始计时，在60℃±1℃条件下反应30min。

3.测定

3.1总磨食纤维的侧定

(1)沉淀：在每份试样中，加入预热至60℃的95％乙醇225mL预热以后的体积），乙醇与样液的体积比为4.1,取出烧杯，盖上铝箔，室温下沉淀1h。

(2）过滤：用78％乙醇15mL将称重过的柑祸中的硅藻土润湿并铺平，抽滤去除乙醇溶液，使坩埚中硅藻土在烧结玻璃滤板上形成平面。乙醇沉淀处理后的样品酶解液倒入坩埚中过滤，用刮勺和78％乙醇将所有残渣转至坩埚中。

(3)洗涤：分别用78％乙醇、95％乙醇和丙酮巧mL洗涤残渣各2次，抽滤去除洗涤液后，将坩埚连同残渣在105℃烘干过夜。将坩埚置干燥器中冷却1h，称重（包括坩埚、膳食纤维残渣和硅藻土），精确至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣质量。

(4）蛋白质和灰分的测定：称重后的试样残渣，分别按GB/T5009.5的规定测定氮（N)，以Nx6.25为换算系数，计算蛋白质质量；按GB/T5009.4测定灰分，即在525℃灰化5h，于干燥器中冷却，精确称量坩埚总质量（精确至0.1mg)，减去柑竭和硅藻土质量，计算灰分质量。

3.2不滚性路食纤维浏定

（1)称取试样，进行酶解，将酶解液转移至坩埚中过滤。过滤前用3mL水润湿硅藻土并铺平，抽去水分使坩埚中的硅藻土在烧结玻璃滤板上形成平面。

(2）过滤洗涤：试样酶解液全部转移至坩埚中过滤，残渣用70℃热蒸馏水10mL洗涤2次，合并滤液，转移至另一600mL高脚烧杯中，备测可溶性膳食纤维。残渣分别用78％乙醇、95％乙醇和丙酮15mL各洗涤2次，抽滤去除洗涤液，并按洗涤干燥称重，记录残渣质量。

(3）测定蛋白质和灰分。

3.3可滚性膝食纤维侧定

(1)计算滤液体积：将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到600mL高型烧杯中，通过称”烧杯十滤液”总质量、扣除烧杯质量的方法估算滤液的体积。

(2)沉淀：滤液加入4倍体积预热至60℃的95％乙醇，室温下沉淀1h。以下测定按总膳食纤维步骤进行。

五、结果计算

空白的质量按式（1)计算：

mB＝(mBR1+mBR2)/2一mpB一mAB…………(1)

式中：mB—空白的质量，mg;

mBR1和mBR2—双份空白测定的残渣质量，mg;

mPB—残渣中蛋白质质量，mg;

mAB—残渣中灰分质量，mg。

膳食纤维的含量按式（2)计算：

X＝[(mR1+mR2)/2]一mp一mA一mB/(m1+m2)/2×100…………（2)

式中：X—膳食纤维的含量，g/100g;

mR1和mR2—双份试样残渣的质量，mg;

mP—试样残渣中蛋白质的质量，mg;

mA一试样残渣中灰分的质量，mg;

mB—空白的质量，mg;

m1和m2—试样的质量，mg。

计算结果保留到小数点后两位。

总膳食纤维（TDF)、不溶性膳食纤维（IDF)、可溶性膳食纤维（SDF)均用式(2）计算。

六、精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

七、说明及注意事项

本方法测定的总膳食纤维（totaldietaryfiber）是指不能被a一淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解消化的碳水化合物聚合物，包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶、部分回生淀粉、果聚糖及美拉德反应产物等；一些小分子（聚合度3一12）的可溶性膳食纤维，如低聚果糖、低聚半乳糖、多聚葡萄糖（polydextrose)、抗性麦芽糊精和抗性淀粉等，由于能部分或全部溶解在乙醇溶液中，本方法不能够准确测量。